1例输入性新冠无症状感染者核酸检验结果分析

吴 剑 龚 虹 黄振东 徐 媛 江艳萍 黄 冠 支林俊 黄国青

邵武市立医院 1 检验科 2 神经内科，福建省邵武市 354000

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情，使全世界深陷其中已两年有余。我国实行严格的“清零”政策，各地虽时有零星疫情发生，但也很快被消灭，但境外人员入境的疫情防控较难管理。2021年11月15日，本实验室1例隔离点“双采双检”新冠核酸检测标本的检验结果与市疾控中心结果不一致，后经标本交叉复查以及重采标本后复查，判定此患者鼻咽拭子新冠核酸检验结果为“阳性”，现将情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源 患者男性，2021年10月18日入境，就地集中隔离观察，隔离期间核酸检验结果均为阴性。11月1日解除隔离后“点对点”闭环转运到本市集中隔离点进行医学观察，期间多次采样，结果均为阴性。11月15日即将解除隔离时按照“双采双检”要求[1]，同时采集鼻咽拭子两管，分别送本市疾控中心与本实验室。(1)样本A1：送市疾控中心的样本。(2)样本A2：送本实验室的样本。(3)样本B：重新采集的双侧鼻咽拭子合并成一管的样本。

1.2 核酸提取 鼻咽拭子置于含胍盐的病毒保存液(浙江康康医疗器械股份有限公司，批号：批210301)中，震荡60s后取200μl样本用核酸提取试剂(中元汇吉生物技术股份有限公司，批号：5108101)在核酸提取仪(山东博科BK-HS32)上经17min提取后获得50μl的RNA溶液。

1.3 核酸扩增

1.3.1 扩增试剂1：某公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，批号：5109014，最低检测限200copies/ml。本产品设有外源性内标，按试剂说明书配制反应体系，反应程序：37℃ 1min；50℃ 5min；95℃ 2min；95℃ 5s；60℃ 30s；(48个循环)，在 60℃进行荧光检验，荧光检验通道选择 FAM/ROX/VIC，passive reference选择 NONE。提取出的核酸放在苏州雅睿实时荧光定量PCR仪(型号MA-6000)上进行扩增。新冠病毒基因N和ORF1ab与内标阳性判断值为<40。

1.3.2 扩增试剂2：另一品牌公司生产的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒，批号：2021099，最低检测限500copies/ml。本试剂盒同时包括内源性内标检测系统，本试剂盒同时包括内源性内标，按试剂说明书配制反应体系，反应程序：50℃ 2min；95℃ 2min；95℃ 5s；60℃ 35s；95℃ 5s；60℃ 35s；(44个循环)，荧光检验通道选择 FAM/VIC/CY5，新冠病毒基因N、ORF1ab与内标阳性判断值为<30。

1.3.3 核酸扩增仪：苏州雅睿实时荧光定量PCR仪,型号MA-6000。

以上采样管、提取仪、提取试剂、扩增仪、扩增试剂组成的检测体系均已通过性能验证实验。

2 结果

第一次采样(双采双检)，本实验室标本(A2)提取两次，中元汇吉试剂扩增两次，N基因与ORF1ab基因未检验到荧光扩增信号，判定结果为“阴性”。但“双采双检”送至市疾控中心的标本(A1)检验结果却为“可疑阳性”。这一情况引起了双方实验室的高度重视，紧急通知隔离点重新采集标本(B)送本实验室，并将标本A1转运至本实验室，A1与B同时用中元与达安两种扩增试剂复核，另将标本A2用达安试剂复核。每份标本提取两次，扩增两次。复查A1的结果是：达安基因扩增为“可疑阳性”；中元汇吉扩增结果为“阳性”；标本A2用达安扩增，N基因与ORF1ab基因及内标均未检测到荧光扩增信号；标本B，用以上两种扩增试剂并行检测结果均为“阳性”。见表1。

表1 本例无症状感染者鼻咽拭子各标本相关基因核酸检验CT值

3 讨论

SARS-CoV-2与宿主易感细胞表面的ACE2受体结合从而侵入机体[2]，其结合的方式与SARS-CoV相似，但亲和力却比SARS-CoV强10～20倍[3]，证明了SARS-CoV-2具有比SARS-CoV更强的传染性与致病性。且SARS-CoV-2属于RNA病毒，相比DNA病毒，其单链结构更易发生变异[4]。我国将COVID-19归为乙类传染病，但采取甲类传染病的预防、控制措施[5]。WHO推荐的识别SARS-CoV-2感染病例的方法是新型冠状病毒核酸检验[6]，此方法也是目前我国新冠疫情防控重要且有效的手段。

新冠核酸检测试剂盒内通常包含内标基因用以避免因标本不合格、核酸提取失败或扩增失败等原因而造成“假阴性”问题[2]。内标基因与标本同时进行提取与扩增，如果实验完成后内标基因未扩增出曲线，则实验失败，需重做并分析查找原因。内标基因通常分为外源性与内源性两类：外源性内标是在试剂配制时加入待测标本中的假病毒核酸片段，能有效监测核酸提取与扩增的全过程，但无法监测标本采样是否合格；内源性内标是人体各组织细胞自带的基因片断，故内源性内标可监测到标本是否合格，但因内源性内标和靶核酸提取效率不尽相同，所以内源性内标不一定能监测到提取过程存在的问题。综上，此二类内标各有优劣。本例无症状感染者第一次“双采双检”时，送到本实验室的鼻咽拭子标本A2用含有外源性内标的扩增试剂1检验，结果为“阴性”，但用含能监控采样质量的内源性内标的扩增试剂2复查时，内标基因未起荧光扩增曲线，推断此份标本采样不合格。如未对此例患者的A2标本进行不同品牌的含不同类型内标试剂复核，则极大可能造成漏检，说明对高风险人群及“可疑”结果的样本，需用不同品牌的试剂交叉复查，才能最大限度保证不漏检。有研究表明鼻咽拭子较口咽拭子阳性率高[7]，但鼻咽拭子的采集难度较大，且因不适感更强或者心理抗拒而导致被采者依从性更低。在一份经验交流中提到[8]鼻咽拭子采集前需与被采者做好充分的沟通，以减轻被采样者的恐惧感，提高依从性，且在采样时要注意“触、停、转”等的操作技巧，以保证标本质量。在充分认识到标本质量的重要性后，重新采集的鼻咽拭子B，经三家实验室(本实验室、市疾控中心与地区疾控中心)共同复核，均为“阳性”结果，证明了标本质量是新冠核酸检验质量保证的重要影响因素之一。

另外，在复检A1标本时，检测限更低的扩增试剂1(200copies/ml)能够把靶核酸的ORF1ab基因与N基因完全扩增出来，而扩增试剂2(最低检测限500copies/ml)仅能得出“可疑”的结果。基于目前国内外均无SARS-CoV-2核酸定量的标准品，国内获批的SARS-CoV-2核酸检验试剂均为定性试剂，则在判断试剂检测灵敏度时，最低检测限是一项尤为重要的指标[9]。有文件[10]建议在新冠核酸检验时选用高灵敏的、最低检测限≤500copies/ml的扩增试剂。特别是对于新冠无症状感染者或弱阳性患者，高灵敏的检验试剂能避免漏检，并更迅速地发现阳性患者而采取有效的隔离与治疗措施。有文件[1]指出当标本初次检测结果为阳性时，应使用另外更加灵敏的试剂对原始标本进行复核后再发报告，以尽量避免检验质量问题的发生。

新冠核酸检验结果阳性是 COVID-19 确诊的金标准，因此，每一份新冠核酸检验报告的质量不容轻视。本市自新冠疫情发生以来无1例本土病例，且此例患者在隔离期间多次核酸检测均为“阴性”结果，如果此次未“双采双检”，则很有可能发生“漏检”的严重事故。为保证新冠核酸检验质量，除了做好室间质量评价与室内质控外，还应该注意检验全流程的质量管理，特别是合规的采样以及对高风险人群、“可疑”结果的标本需进行不同品牌试剂的交叉复核。