苏云金芽孢杆菌对二化螟致病力及与助剂协同作用研究

于洪春，任中杰，王紫君，裴海英

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

二化螟[Chilo suppressalis（Walker）]属鳞翅目，螟蛾科，为钻蛀性害虫，主要危害水稻、玉米、大麦、茭白等植物，是热带及亚热带地区主要农业害虫之一，在亚洲、北非和南欧等地均有发生[1-2]，因全球气候变暖和耕作栽培制度改变，二化螟在我国适生地不断北扩[3]，目前已向北扩散至黑龙江省佳木斯地区。作为影响我国粮食生产“十大病虫害”之一[4]，二化螟每年对我国水稻造成约115亿人民币经济损失[5]。目前，化学防治在二化螟防治中占主导地位，不仅加重害虫抗药性、杀伤天敌、污染环境[6]，且导致水稻品质与产量下降。农业害虫绿色防控技术发展和完善是保障粮食安全、构建绿色生态环境的重要环节[7]。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种对害虫毒力强，对天敌、高等动物和人类无毒的革兰氏阳性细菌[8]，是鳞翅目害虫防治的主要非化学杀虫剂。研究表明，Bt蛋白Cry2Ah1对二化螟具有较好杀虫效果[9]，转Bt水稻可显著降低二化螟幼虫数量[10]。目前，Bt生物制剂用于防治田间二化螟，表现较好防治效果[11]。因不同Bt菌株对同一靶标害虫杀虫活性差异较大，针对特定农林害虫高效Bt菌株筛选及保证Bt杀虫稳定与高效是后续Bt制剂研发与可持续发展重要环节[8]。研究表明表面活性助剂可提高化学杀虫剂防治效果并减少农药使用量[12-13]，但其与Bt混用对害虫协同增效作用尚未见详细报道。

文章在前期36株Bt菌株对二化螟幼虫杀虫活性初步测定基础上，选择杀虫活性较高的8株Bt菌株，采用生物测定法，筛选出最高致病力Bt菌株，测定其对二化螟不同虫龄幼虫致病力，研究其与助剂混用协同作用，以期筛选出对二化螟高致病力Bt菌株及增加菌株杀虫活性助剂，提高Bt对二化螟防治效果和应用水平，对二化螟绿色高效防控、化学农药减量、粮食安全高质生产具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试虫源

二化螟虫源自哈尔滨市郊区稻田，用便携式黑光灯诱集成虫。将成虫带回实验室，在培养皿底铺润湿滤纸，其上放置两片长8～9 cm新鲜水稻叶片，将雌成虫1～2头放入培养皿中产卵，孵化出幼虫，在25℃人工气候箱内饲养至不同虫龄作为试虫。

1.1.2 食料

饲喂二化螟水稻品种为东农425，在东北农业大学盆栽场栽植于整理箱或塑料桶中，用于二化螟食料及室内外生物测定和防治效果试验。

1.1.3 供试菌株或分离株

供试菌株标号Bt6、Bt12、Bt29、Bt48、Bt49、Bt64、Bt65、Bt75，为前期试验筛选出对二化螟有较高杀虫活性的苏云金芽孢杆菌菌株或分离株，均为东北农业大学害虫生物防治研究室自有菌株。

1.1.4 培养基

LB固体培养基：每100 mL培养基中，加入蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，牛肉膏0.3 g，琼脂2 g，加水定容，精密pH试纸测定培养基pH，5%氢氧化钠溶液调节至pH 7.4～7.6。

1.1.5 供试助剂和生物农药

八神，购自黑龙江印家农业发展有限公司；激健，购自成都激健生物科技有限公司；有机硅，购自江西中迅农化有限公司；16 000 IU·mg-1苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂，购自湖北康欣农用药业有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养与计数

在无菌操作台中，将供试8株Bt菌株用划线法接种到表面干燥的LB斜面培养基上，置于（28±1）℃恒温培养箱中培养72 h。无菌水刮洗菌落，转移到无菌锥形瓶中在恒温磁力搅拌器上搅拌20 min，使芽孢均匀分散。采用10倍稀释法稀释1 000倍，血球计数板计数并计算菌悬液芽孢浓度。

1.2.2 二化螟高致病力苏云金芽孢杆菌菌株筛选

用无菌水将已计数的各菌株分别稀释成1×105、1×106、1×107、1×108、1×109芽孢·mL-1菌悬液，采用浸渍法将分蘖初期带有新鲜叶鞘水稻秆（10 cm左右）浸泡在装有菌悬液离心管中，平放于桌面静止1～2 min，取出放入铺有湿润滤纸的养虫盒内，每盒放入4根稻秆并按“井”字型摆放，用小软毛刷对每个处理接入20头2龄幼虫，设置无菌水对照，试验重复3次。将养虫盒置于25℃，相对湿度85%，光周期16 h∶8 h（L∶D）光照培养箱中。接虫5 d，扒秆调查各处理死虫数，更换新鲜无菌稻秆供给活虫。接虫7 d再调查1次。计算各处理死亡率和校正死亡率，求得各菌株第7天毒力回归方程及致死中浓度LC50，筛选出对二化螟致病力高的Bt菌株。

1.2.3 苏云金芽孢杆菌对不同虫龄幼虫致病力

将1.2.2筛选出的最高致病力Bt菌株按1.2.1方法培养计数，用无菌水将菌液稀释至1×105、1×106、1×107、1×108、1×109芽孢·mL-15个浓度梯度，浸渍法处理水稻秆，分别饲喂1、2、3、4龄幼虫，每个处理20头幼虫，设置无菌水对照，3次重复。试验处理、调查和统计方法同1.2.2，计算菌株对不同虫龄在第7天毒力回归方程并比较各龄幼虫致死中浓度LC50。

1.2.4 苏云金芽孢杆菌与助剂混用对二化螟协同作用

根据1.2.2结果，将最高致病力Bt菌株，分别用3种助剂推荐使用浓度的溶液将Bt菌株配制成LC70（3.5×107芽孢·mL-1）和5×108芽孢·mL-12个浓度，以无菌水作对照，按1.2.2试验方法，处理3龄初幼虫，每处理20头试虫，重复3次。计算各处理死亡率和校正死亡率，分析不同助剂对Bt菌株杀虫活性协同作用。

1.2.5 室外条件苏云金芽孢杆菌与助剂混用对二化螟防治效果

根据1.2.4试验结果，将Bt菌株与协同效果最好助剂混用进行室外盆栽试验。试验设置推荐稀释浓度助剂、助剂与Bt菌株LC70、5×108芽孢·mL-12个浓度混用、助剂与商品Bt 800倍混用，Bt菌株LC70、5×108芽孢·mL-12个浓度单用共6个处理。在室外将3龄初幼虫均匀接到盆栽水稻叶鞘上，每处理20头，3次重复。接虫24 h后，于傍晚对水稻进行等量喷雾处理。施药7 d对各处理水稻进行扒秆调查，统计各处理活虫数量，计算死亡率和校正死亡率。

1.2.6 数据处理与分析

采用DPS（V7.05）软件处理分析生物测定数据，计算各菌株毒力回归方程、相关系数和致死中浓度LC50。致死中浓度比率测定法分析各菌株间毒力及菌株对不同虫龄间毒力差异显著性。SPSS 26.0数据统计分析软件对Bt菌株与助剂协同作用试验数据作单因素差异显著性分析，邓肯氏新复极差法作多重比较。

死亡率（%）=（处理前活虫数-处理后活虫数）/处理前活虫数×100；

校正死亡率（%）=（处理组死亡率-对照组死亡率）/（100-对照组死亡率）×100。

2 结果与分析

2.1 二化螟高致病力苏云金芽孢杆菌菌株筛选

8株Bt菌株对二化螟2龄幼虫毒力测定结果见表1。不同菌株在相同浓度下杀虫活性不同，随处理时间延长幼虫校正死亡率有升高趋势，同一菌株对幼虫校正死亡率随浓度升高而增加。供试菌株不同浓度处理7 d，二化螟幼虫最低校正死亡率为10.71%，最高校正死亡率为98.21%。

表1 8株Bt菌株对二化螟2龄幼虫的毒力测定Table 1 Toxicity of eight Bt strains to 2nd instar larvae of Chilo suppressalis

8株Bt菌株处理二化螟2龄幼虫7 d毒力回归方程、相关系数及致死中浓度（LC50）见表2。菌株Bt29、Bt64、Bt65、Bt75的LC50均 小 于1.9170×106芽孢·mL-1，对二化螟2龄幼虫表现出较高致病力。在供试菌株中，菌株Bt64的LC50为2.09×105芽孢·mL-1，对二化螟幼虫毒力最强；菌株Bt6的LC50为4.6933×107芽孢·mL-1，对二化螟幼虫致病力最差。

8株Bt菌株毒力差异显著性比较结果见表3。利用致死中浓度比率测定法对各供试菌株毒力作两两比较，菌株Bt6与其他7株毒力存在显著差异，菌株Bt64与其他7个菌株毒力均存在显著差异，菌株Bt12与Bt65和Bt75毒力存在显著差异。结合表2和表3，确定菌株Bt6对二化螟2龄幼虫致病力最低，显著低于其他菌株；菌株Bt64对二化螟2龄幼虫致病力最高，显著高于其他菌株，被确定为最高毒力Bt菌株。

表2 8株Bt菌株对二化螟2龄幼虫第7天毒力回归方程和致死中浓度Table 2 Virulence regression equation and median lethal concentration of eight strains of Bt to the 2nd instar larva of Chilo suppressalis on the 7th day

表3 8株Bt菌株毒力差异显著性比较Table 3 Comparison of virulence of eight strains of Bt strain

2.2 菌株Bt64对二化螟不同虫龄幼虫致病力

菌株Bt64对二化螟不同虫龄幼虫致病力见表4。随菌株浓度升高，不同虫龄校正死亡率增加；随处理时间延长，各浓度二化螟幼虫校正死亡率均有升高趋势。第7天，菌液浓度为1×105芽孢·mL-1浓度下，4龄幼虫校正死亡率最低为18.21%，2龄最高为48.21%；菌液浓度为1×109芽孢·mL-1浓度下，1龄、2龄、3龄幼虫校正死亡率均达到88%以上，4龄幼虫为76.37%，其中1龄最高为98.18%，其次是2龄为96.43%。生物测定结果表明，菌株Bt64对二化螟幼虫致病力随虫龄增加而降低。

表4 菌株Bt64对二化螟不同虫龄幼虫致病力Table 4 Pathogenicity of the No.64 Bt strain against larvae of different instars

菌株Bt64对二化螟1～4龄幼虫第7天毒力回归方程、相关系数以及致死中浓度见表5。菌株Bt64对二化螟1龄、2龄、3龄、4龄幼虫毒力回归方程分别为Y=0.5853X+5.7716、Y=0.4491X+5.7543、Y=0.4851X+5.2620、Y=0.3934X+4.7749。菌株Bt64对二化螟各龄幼虫致死中浓度从大到小依次为：4龄（3.7341×107芽孢·mL-1）＞3龄（2.884×106芽孢·mL-1）＞1龄（4.81×105芽孢·mL-1）＞2龄（2.09×105芽孢·mL-1）。

表5 菌株Bt64对二化螟不同虫龄幼虫第7天毒力回归方程及致死中浓度Table 5 Toxicity regression equation and median lethal concentration of the different instar larvae on the 7th day under No.64 Bt strain

采用致死中浓度比率测定法将菌株Bt64对各虫龄毒力作两两比较，结果见表6。菌株Bt64对二化螟1龄幼虫毒力显著高于3龄和4龄，对2龄毒力显著高于3龄和4龄，对3龄毒力显著高于4龄，而对1龄和2龄幼虫毒力没有显著差异。因此，菌株Bt64对二化螟1～2龄幼虫致病力最强，其次是3龄幼虫，对4龄幼虫致病力最弱。

表6 菌株Bt64处理二化螟各虫龄幼虫毒力差异显著性比较Table 6 Significant comparison of virulence differences at each instar larvae after No.64 Bt strain

2.3 菌株Bt64与不同助剂混用协同作用

菌株Bt64与3种助剂混用对二化螟幼虫协同作用见表7。单独施用3种助剂7 d，校正死亡率均低于5.35%，对幼虫几乎无毒害作用。菌株Bt64 LC70浓度，不加助剂5和7 d二化螟幼虫校正死亡率分别为44.07%和67.86%；加入八神、激健、有机硅3种助剂处理5和7 d，校正死亡率分别为49.15%、52.24%、52.54%和69.64%、76.78%、73.21%，高于菌株单用杀虫活性。差异显著分析表明，菌株Bt64以LC70浓度与助剂激健混用处理幼虫校正死亡率均显著高于不加入助剂处理（P＜0.05）。5×108芽孢·mL-1浓度，不加助剂5和7 d幼虫校正死亡率分别为67.80%和76.78%；加入八神、激健、有机硅3种助剂处理5和7 d，校正死亡率分别为71.19%、76.27%、69.49%和78.57%、89.29%、80.36%，高于菌株单用杀虫活性。差异显著分析表明，菌株Bt64以5×108芽孢·mL-1浓度与助剂激健混用处理5 d幼虫校正死亡率显著高于不加助剂处理（P＜0.05），7 d极显著高于不加入助剂处理（P＜0.01），其他助剂对提高菌株Bt64杀虫活性不显著（P＞0.05）。研究结果表明，助剂激健和菌株Bt64混用有较好协同增效作用。

表7 菌株Bt64与不同助剂混用对二化螟幼虫的协同作用Table 7 Synergistic effect of No.64 Bt strain mixed with different adjuvants on larvae

2.4 菌株Bt64与激健混用对二化螟幼虫室外防治效果

室外试验，菌株Bt64与助剂激健混用7 d对二化螟3龄初幼虫防治效果如图1所示。单独使用激健对幼虫无防治效果。单独使用菌株Bt64，在LC70和5×108芽孢·mL-1浓度下，对幼虫7 d防效分别为53.06%和67.35%；与激健混用防效分别为65.31%和79.59%。同浓度下，菌株Bt64加入激健处理对二化螟幼虫防效显著高于不加助剂处理（P＜0.05）。商品Bt制剂与激健混用处理防效为49.94%，与菌株Bt64 LC70浓度单用无显著差异（P＞0.05），显著低于菌株Bt64 5×108芽孢·mL-1浓度单用和2种浓度加入激健处理（P＜0.05）。表明菌株Bt64对二化螟防效优于商品制剂，可作为防治二化螟优良生防菌株，激健与菌株Bt64混用具有良好协同增效作用，可作为菌株Bt64增效助剂。

图1 菌株Bt64与激健助剂混用对二化螟幼虫的防治效果Fig.1 Control effect of No.64 Bt strain mixed with Jijian on Chilo suppressalis larvae

3 讨论与结论

苏云金芽孢杆菌虽然杀虫范围广泛，对16个目3 000多种害虫有杀虫活性[14]，但因其含有较多亚种，不同亚种菌株产生毒素种类和性质不同，表现不同杀虫谱活性[15]。因此，筛选出对特定目标害虫毒力较强菌株是开展Bt应用前提。文章在前期初筛基础上，从36株Bt菌株中获得对二化螟杀虫活性较高8株菌株，通过生物测定方法，筛选出对幼虫致病力最强菌株Bt64。对二化螟不同虫龄幼虫致病力存在较大差异，1～4龄幼虫致死中浓度LC50分别为4.81×105、2.09×105、2.89×106和3.73×107芽孢·mL-1，对1～2龄幼虫杀虫活性显著高于3～4龄。由于二化螟1～2龄幼虫群集在水稻叶鞘为害，3龄以后钻蛀到茎秆为害，故1～2龄幼虫期是Bt防治二化螟最佳时期。室外防治试验表明，菌株Bt64 5×108芽孢·mL-1对3龄初二化螟第7天防治效果达67.35%，显著高于商品Bt制剂推荐使用浓度防治效果（49.94%），表明菌株Bt64是对二化螟有生物防治应用前景的生防菌株。同时，菌株Bt64对其他农业害虫也表现较高杀虫活性，对稻螟蛉2龄幼虫致死中浓度LC50为1.89×105芽孢·mL-1（未发表），对黏虫2龄幼虫致死中浓度LC50为5.25×106芽孢·mL-1[16]，预示菌株Bt64作为生物菌株具有较高开发应用价值。有关菌株Bt64杀虫晶体基因和其他特性有待后续进一步研究。

基于Bt开发杀虫剂是全球最畅销、应用最广泛、对人畜安全的高效昆虫病原微生物杀虫剂[11]，但存在杀虫速度缓慢，受环境影响大，防治效果低于化学农药的问题[17]。为提高微生物农药杀虫速度和杀虫效果，可将其与低量化学农药混用[18-19]，金党琴等报道Bt和植物源杀虫剂印楝素联合对二化螟有协同增效作用[20]。表面活性助剂对化学杀虫剂增效作用显著报道较多[12,21]，其与Bt协同作用研究文献较少。为明确表面活性助剂对Bt菌株是否存在协同增效作用，减少用菌量和降低防治成本，保证较高防治效果，本文将激健、八神、有机硅3种助剂与室内生物测定校正死亡率达到约70%～80%菌株Bt64 2种浓度菌液混用，证实混用对二化螟幼虫杀虫效果均高于菌株Bt64单用，协同增效作用表现为激健＞八神＞有机硅，激健对菌株Bt64增效作用最高；室外防治试验证明菌株Bt64与激健混用对二化螟防治协同增效作用显著，可提高防治效果12%以上，相对防效提高20%。其中菌株Bt64 5×108芽孢·mL-1与激健混用7 d实际防效为79.59%，达到防治需求。激健主要成分是食品级茶籽油、橄榄油、大豆油、玉米胚芽油，是一种非离子表面活性助剂，增加药液渗透力和传导率。八神主要成分为复合型改性植物油、复合型糖醇类非离子表面活性助剂，增加药液润湿性、展布性和渗透性。有机硅助剂则是一类硅氧烷表面活性剂，主要增加药液润湿性和展布性。助剂几乎无毒并对二化螟幼虫无杀虫活性，其提高菌株Bt64杀虫活性原因是二化螟幼虫3龄前在水稻叶鞘内蛀食为害，稻株表面由于存在蜡质层难以被水润湿[22]，使用助剂，尤其是渗透性强的激健，可明显改善菌悬液在稻株表面展着性和渗透性，有利于菌液渗入叶鞘，增加钻蛀幼虫对Bt取食量。因此，苏云金芽孢杆菌与助剂混用是提高田间Bt防治二化螟杀虫效果重要途径。