STAT4 rs7574865单核苷酸多态性与ANCA相关性血管炎的关系

曹越琦，薛超

原发性抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）是一种以ANCA 阳性为特征、累及全身多脏器的自身免疫性疾病，根据病理表现分为显微镜下多血管炎、嗜酸性肉芽肿性多血管炎和肉芽肿性血管炎3种类型［1］。我国约80%的AAV患者表现为显微镜下多血管炎，肉芽肿性多血管炎次之，占比小于20%，嗜酸性肉芽肿性血管炎相对少见［2］。近年来，随着治疗手段的进步，AAV 已从致死性疾病转变为慢性疾病，但其发病机制仍不明确。研究认为其与遗传因素密不可分［3-4］。信号转导和转录激活因子-4（STAT4）基因编码产物主要局限于淋巴系统及髓系内，表达于炎症部位的免疫相关性细胞胞浆，在体内调控多种炎症介质信号通路，介导辅助性T（Th）1 细胞和Th17 细胞分化、凋亡。多种自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）和干燥综合征中均存在Th1、Th17 细胞数量及功能紊乱［5-7］，故推测STAT4 基因可能在自身免疫性疾病发生、发展过程中起到重要作用。目前有关STAT4单核苷酸多态性与AAV 易感性的相关研究较少，STATA4 在AAV中的遗传机制不详，本研究选取STAT4 rs7574865位点，探寻该位点在AAV中的遗传学意义以及与AAV临床症状之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组 选取2005年1月—2018年12月就诊于广西医科大学第二附属医院的AAV 患者。纳入标准：（1）诊断符合2018年增编版第二届Chapel Hill 国际血管炎命名会议诊断标准［8］。（2）ANCA 阳性。（3）原发AAV 患者。排除标准：肿瘤、药物、多脏器衰竭、妊娠以及继发于其他自身免疫性疾病所致的血管炎。共纳入145例为AAV组，其中男59例，女86 例，年龄19～82 岁，平均（53．99±14．97）岁；选取同期216 例体检的健康人群作为对照组，其中男84 例，女132 例，年龄18～81岁，平均（51．35±12．65）岁。收集患者就诊时是否伴发热、蛋白尿、血尿、咯血症状。本研究经广西医科大学第二附属医院医学伦理委员会批准（2018 第KY-0100 号）。所有研究对象均知情同意。

1.2 基因信息 通过千人基因组计划（http：//grch 37．ensembl．org/）查阅STAT4rs7574865 基因位点的信息，STAT4 rs7574865 符合最小等位基因频率（MAF）≥0．05，且位于STAT4 基因的功能区。基因分为野生型（GG）、杂合突变型（GT）、纯和型（TT）。遗传模型：隐性模型（TTvs.GT+GG）、显性模型（GT+TTvs.GG）、超显性模型（GG+TTvs.GT）。

1.3 基因分型 采用多重PCR结合高通量测序（MPCR-HTS）方法［9-10］（上海生工生物工程有限公司）进行基因分型。设计引物序列，上游引物5'-TGTATGCAGTAAAAGTATGAAAAGTTGGTG-3'，下游引物5'-TTTTTCCACTTCTTGCTTTAGGAGTTCTAA-3'。合成位点引物池。第一轮扩增STAT4 rs7574865序列，PCR体系包含DNA模板2 μL、上游引物池1 μL、下游引物池1 μL、2×PCR Ready Mix 15 μL、RNase-free H2O 6 μL。使用PCR 仪器（BIO-RAD，T100TM）进行扩增，步骤：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8个循环；98 ℃变性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 个循环后以72 ℃延伸5 min。以上过程结束后，产物以4 ℃保存，1%琼脂糖凝胶电泳测试产物大小，AMPure XP磁珠纯化PCR产物。第二轮PCR反应体系包括：第一轮PCR产物2 μL、通用P7引物1 μL、通用P5引物1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL、RNase-free H2O 11 μL（总反应体积30 μL）。混匀体系后进行PCR反应：98 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5个循环；最后72 ℃延伸5 min，反应结束以4 ℃保存产物。终PCR 产物用AMPure XP 磁珠纯化回收后利用HiSeq XTen 测序仪（Illumina，SanDiego，CA）进行测序。

1.4 统计学方法 Hardy-Weinberg 平衡使用SHEsis 在线软件分析，P＞0．05为符合Hardy-Weinberg 平衡，提示群体具有代表性。采用SPSS 22．0 软件用于数据分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。采用Logistic 回归分析基因型与临床症状发生风险的关系。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型及等位基因分布 2 组均符合Hardy-Weinberg 平衡（对照组：χ2=1．447，P=0．229；病例组χ2=0．722，P=0．396），2 组间基因型和等位基因分布差异无统计学意义，见表1。

Tab.1 Comparison of genotype and allele between the two groups表1 2组间基因型和等位基因分布对比

2.2 不同遗传模型与AAV关系 不同遗传模型下，2组基因型分布差异无统计学意义，见表2。

Tab.2 Comparison of genotype in genotypic models between the two groups表2 2组不同遗传模型基因型对比

2.3 基因型和等位基因在不同临床症状中的分布 根据AAV组是否伴血尿、蛋白尿、咯血、发热的临床症状分亚组，不同亚组中基因型、等位基因分布差异均无统计学意义，见表3。

2.4 各临床症状亚组不同遗传模型下基因型分布 隐性模型下，血尿组TT基因型分布比例低于无血尿组（P＜0．05），余亚组间不同模型下基因型分布差异无统计学意义，见表4。

2.5 隐性模型下基因型与血尿发生风险分析 以是否有血尿发生（否=0，是=1）为因变量，基因型（TT=1，GG+GT=2）为自变量进行Logistic 回归分析，结果显示TT 基因型与血尿发生风险无关［（β=-1．873，SE=1．049，Wald χ2=3．187，OR（95%CI）＝0．154（0．020～1．201），P=0．074］。

Tab.3 Comparison of genotypes and allelic distribution between AAV clinical symptom subgroups表3 各AAV临床症状亚组基因型及等位基因分布比较

Tab.4 Comparison of genotype distribution under different genetic models between different clinical subgroups表4 各临床亚组不同遗传模型下基因型分布比较

3 讨论

STAT4 定位于细胞质，具有DNA 结合结构域，可特异性地介导来自干扰素诱导的靶细胞因子受体酪氨酸磷酸化的信号［11］。当其被激活后，会以二聚化的形式移至细胞核，进而影响下游靶基因的转录和表达［12］。被激活的STAT4 具有促炎作用，参与自然杀伤细胞、肥大细胞、树突状细胞和Th 细胞的功能调节和分化，导致Th1/Th2 分化率向Th1 侧转移，激活特定的Th1 分化并抑制Th2 反应［13-14］。STAT4主要表达于炎症部位的免疫调节细胞中，被称为“人体免疫调节剂”，在多种自身免疫性疾病中具有重要作用［15］。

目前国内外有关STAT4 rs7574865 单核苷酸多态性与AAV易感性的研究较为缺乏，但其在其他自身免疫性疾病中的研究多有报道。有研究发现，在中国武陵山区的类风湿关节炎（RA）患者中，rs7574865 的TT 基因型和T 等位基因均与RA 易感性相关，且为发病的危险因素，但与患者的类风湿因子或抗环瓜氨酸抗体抗体水平无关［16］。在RA 中，STAT4的异常激活可促进Th1和Th17细胞的分化增殖，是RA 致病的关键炎症效应因子之一［17］。一项Meta 分析显示，T 等位基因与在亚洲人和欧洲人的SLE易感性之间存在关联，基因型TT、GT、TT+TG和SLE 易感性相关［18］。此外，在我国北方汉族人群中研究发现SLE患者的T等位基因频率明显高于健康对照组，尤其在男性SLE 患者中［19］。一项伊朗SLE的研究也发现，rs7574865 T 等位基因是SLE 发病的危险因素，TT 基因型和GT 基因型与SLE 易感性相关［20］。Kariuki 等［21］发现欧洲和非洲裔美国人SLE患者血清中干扰素α 水平高于正常人，STAT4 rs7574865的基因多态性影响IFNα对外周血单个核细胞的敏感性，促进干扰素α诱导的基因表达，增加的干扰素α 信号通路为SLE 的危险因素，表明STAT4 rs7574865 的单核苷酸多态性与SLE 易感性有关。STAT4 rs7574865 单核苷酸多态性亦与我国江苏省部分地区汉族人群原发性胆汁性肝硬化（PBC）易感性有关［22］。在日本人群PBC 中发现，STAT4 基因遗传变异通过影响IL-12 信号通路进而影响PBC发生，而患者血清中ANA的滴度水平也与STAT4 基因多态性有关［23］。此外，rs7574865 T 等位基因和GT 基因型与埃及患者的1 型糖尿病易感性有关［24］。rs7574865 T 等位基因携带者与系统性硬化症（弥漫型）易感性相关，并与患者并发间质性肺病、心脏损伤有关，与患者血清中抗拓扑异构酶I抗体（ATA）滴度水平有关［25］。从上述研究可见，STAT4 rs7574865的单核苷酸多态性在不同人种，不同疾病中均起关键致病作用。本研究结果显示，血尿组TT 基因型分布比例低于无血尿组，经Logistic回归分析发现TT 基因型与血尿发生无关。本课题组既往研究显示STAT4 rs10181656 多态性与AAV患者血尿发生有关［26］，而肾脏作为AAV较易累及的靶器官，临床上时常会出现蛋白尿、血尿，甚至危及生命的肾功能衰竭，其分子机制及治疗手段仍值得更多学者深入研究探索。

综上，STAT4 rs7574865单核苷酸多态性与AAV易感性无关，与患者血尿、蛋白尿、咯血、发热的临床症状不相关。本研究结果不除外在抽样上存在偏倚的可能，后续研究中应扩大样本量，并在生物机制层面深入探究。