二代测序技术在颅内感染中的应用

吴佳诺 苏高健 邓宇航 李欣梦 刘紫薇 黄贤键

深圳大学第一附属医院深圳市第二人民医院，广东 深圳 518000

颅内感染是神经外科常见疾病之一，也是神经外科术后严重并发症之一，且颅内感染不同于其他部位的感染，不仅病情进展迅速而且由于血脑屏障的存在，很多药物难以在颅内达到血药浓度［1］。现阶段院内颅内感染往往以耐药菌为主，因此确定病原菌种类尤其重要［2-3］。二代测序技术（next generation sequencing technology，NGS）作为一种基于PCR 和基因芯片发展而来的DNA 测序技术，不同于经典的细菌或真菌培养、涂片等方法，该技术凭借高通量、快速高效、高精度描述病原体的转录组和基因组，可以精准地分析病原体类型［4］；有利于深化人们对于神经系统感染性疾病的认识，尤其是对于一些罕见的病原体感染的认识，从而可以更好地指导临床诊断与治疗。

1 神经系统感染性疾病诊断现状

神经系统感染性疾病是由病原体入侵中枢神经系统或外周神经系统导致人体出现相应临床症状的一组疾病，具体可表现为脑或脊髓炎，脑膜或脊膜炎，脑脓肿等，可由细菌、病毒、真菌、立克次体、寄生虫等多种病原体引起［3-5］。在NGS 推广应用于临床之前，神经系统感染性疾病的诊断主要依靠检测脑脊液白细胞、化合物、病原体培养甚至脑组织活检，但受限于颅内感染病原体培养时间长且容易受到污染菌干扰、组织取材困难等因素［6］。NGS技术可以高通量、高效率的检出病原体［7］，不依赖经典的病原体培养，不需要使用特定的引物，只需一次运行即可测得所感染病原体类型及菌落特点，并可提供耐药性预测等信息从而为临床诊治提供帮助［8］。NGS 自第1例检验并诊断颅内感染病例至今，其已推广应用于临床很长时间。现有临床研究表明NGS很可能成为神经系统感染性疾病的重要诊断工具，尤其是对于罕见病原体诊断其已具有无法替代的作用，另外NGS也可以检出一些目前未知的会引发神经系统感染病原体［9］。2012年北京协和医院运用高通量检测技术，从一名疑似为病毒性脑炎患儿脑脊液中检出Parechovirus病毒（副肠孤病毒）［10］。2015年Sakiyama等［11］报道4例表现为脑脊髓膜炎的渔民，他们在常规检查包括活检都未能明确致病病原体，但通过NGS检测明确其感染既往未报道过的属于古细菌域的嗜盐菌（Halobacterium），诊断明确后给予复方磺胺甲恶唑治疗后患者完全好转。由此可见，NGS 在罕见及未知病原体检测方面有极大的潜力［5-6］。

2 NGS技术原理简介

自1975 年Sanger 和Coulson 开创链终止法测序技术（Sanger 测序技术/一代测序技术）［12］，并由Sanger 于1977 年测定了第一个基因序列，人们从此步入了基因组学时代［13］。一代测序技术虽可以测长达1 000 bp 序列［14-15］，且准确率高达99.999%，但由于其测序成本高、通量低，NGS 技术应运而生。NGS技术主要步骤如下［16-18］：首先，利用超声波将待测DNA 样本打断成200～500 bp 的片段，并在这些片段两端添加不同接头，从而构建出DNA 文库；其次，使DNA 片段通过Flow cell（用于吸附DNA 片段的槽道），DNA 片段会随机吸附于Flow cell 的通道上，通道上的接头可与DNA 片段上的接头连接从而支持DNA片段在其表面上桥式PCR扩增，待形成1 000个拷贝后就形成了簇。向反应体系中同时加入DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4 种dNTP，接着加入激发荧光所需的缓冲液并用激光激发荧光信号；最后，运用计算机将荧光信号转化为测序碱基，并提供生物体全面功能图，通过生物信息软件进行分析，在基因组流行病学中心网站上分析NGS 数据，与已知参考基因作比对、定位以及整合分析。

3 NGS技术在神经系统感染性疾病中的应用

3.1 NGS 在细菌方面的应用细菌性颅内感染是神经外科术后常见并发症之一［19］，据统计全球每年因化脓性细菌所引起的化脓性脑膜炎（purulent meningitis，PM）病例数高达120 万之多，在欧美等发达国家中成年人发病率为0.4‰～0.6‰［20］，目前国内尚缺乏此类流行病学数据。由于广谱抗生素滥用、病原学诊断不明等因素，化脓性脑膜炎病死率高达30%～50%，且约50%存活者会出现神经后遗症［15］。早期精准诊断及早期正确使用抗生素可提高患者存活率及减少后遗症，研究显示传统分离培养检测特异度高达97%，但敏感度不稳定，波动于25%～90%［21］。NGS 作为一种新兴的检验技术可以显著提高PM 诊断准确率及诊断效率，运用传统脑脊液涂片或培养联合NGS可将敏感性提升至68.7%［15，22］。由此可见，NGS与传统涂片或培养互补，可明显提高PM病原菌的确诊率，从而降低PM致死率及致残率。

3.2 NGS 在真菌方面的应用真菌性脑膜炎是由真菌（包括霉菌、酵母菌及二项性真菌）所引起的中枢神经系统感染性疾病，其起病隐匿，多表现为亚急性或慢性，目前临床上诊断的“金标准”为病理学检查［23］。但病理学检查是有创检测且存在取材相对困难的劣势，而脑脊液NGS取材相对容易，灵敏度较高且特异性较强。文献报道全球每年新发约22万例隐球菌性脑膜炎病例，致死率高达80%［24］。隐球菌性脑膜炎发病隐匿且影像学表现不明显，目前诊断主要依靠脑脊液墨汁染色、真菌培养以及荚膜抗原检测。运用NGS 诊断隐球菌性脑膜炎，其敏感度为75%，特异度为99.47%，阳性率为90%，阴性率为98.43%［15］。传统检测方法中仅有荚膜抗原染色敏感度高于NGS，其特异性略低于NGS，但由于荚膜抗原染色依赖荚膜结构，而缺乏荚膜结构的隐球菌所致隐球菌性脑膜炎则无法检测。由此可见，隐球菌性脑膜炎疑似感染者应尽早采用多种检测方法联合检验以提高检出率，从而为治疗方案提供依据，NGS有潜力成为针对真菌性中枢性神经系统感染的一线检测方法。

3.3 NGS 在病毒方面的应用病毒是中枢神经系统感染最常见的感染病原体，其中以病毒性脑炎、脑膜炎为主［25］。已知至少100 种病毒可导致中枢神经系统感染，其中以单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、腺病毒为主。病毒性脑炎诊断的金标准是脑活检中发现病毒颗粒，但该检查是一种侵入性检查，不仅对患者创伤大而且花费高［26］，目前临床诊断以传统实验室检查及影像学检查为主，但只有不到50%的患者可发现特异病原体，因此临床治疗往往依靠经验治疗［27］。在一项46份脑脊液样本的研究中，将NGS与传统PCR 进行对比，发现46 份CSF 样本中有6 份PCR 呈阳性，而有14 份NGS 呈阳性，表明NGS 与传统PCR分析相比，检测率显著提高［28］。研究表明，病毒性脑炎早期进行NGS 其阳性率为58.33%，而在后期进行NGS其阳性率下降［15］。虽然NGS对于病毒性脑炎检出率不高，但早期行NGS 联合实验室检查是有必要的。

3.4 NGS 在寄生虫方面的应用临床上颅内寄生虫确诊率低，影响神经系统寄生虫病的诊治。脑寄生虫病中最常见的为脑囊虫病，其致病病原体主要为猪带绦虫，其临床表现极为复杂，主要取决于囊尾蚴的寄生部位、种类、数量、大小以及宿主对囊尾蚴的免疫反应等［29］，病程缓慢，最长可至30 a［30］。目前临床诊断主要依靠影像学及脑脊液常规生化，但往往缺乏特异性，尤其是非脑实质的脑囊虫病。NGS可检测标本中全部基因组序列，寄生虫的DNA 可在驱虫治疗后长时间留存于脑脊液之中。2021年深圳市儿童医院利用NGS测序确诊2例儿童广州管圆线虫（angiostrongylus cantonensis，AC）脑膜炎，在予以阿苯达唑治疗后，2 例患儿均完全好转，此2 例患儿在确诊寄生虫感染前按细菌性脑膜炎治疗均无好转，其中1 例患儿反而加重［31］。目前针对寄生虫的NGS 检测技术主要集中在基因组测序、基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选、耐药基因监测等方面［32］。

4 NGS技术面临的困境

4.1 标本取材困难自NGS 技术在临床应用以来，成功检测颅内病原体的病例时有报道，但NGS 技术也面临一些困境。由于血脑屏障的存在，脑脊液病原学检测是诊断颅内感染的金标准［33］。中枢神经系统感染性疾病标本取材复杂且标本量较少，很大程度上制约了NGS在诊断中枢神经系统感染性疾病的准确性。脑脓肿或局限于脑实质中的感染性疾病，进入脑脊液中的病原菌不多，甚至需取脑组织进行检测［15］。脑组织取材更为复杂，因此NGS 技术对此类疾病的诊断有很大帮助。必须注意的是取材过程中须严格执行无菌操作，若标本被环境中的微生物污染将会影响NGS的检出率。

4.2 敏感性有待提高NGS技术虽然在检测罕见病原体方面有很强灵敏度，但报道称在部分结核分枝杆菌、隐球菌等病原体的检出率不如经典检测方法，已确诊中枢神经系统感染性疾病的5 例患者，运用NGS测序后并没有检出感染病原体［34］。结核分枝杆菌目前主要检测方法是传统培养、涂片，结核菌γ干扰素释放试验及PCR，其中传统培养检测方法为诊断结核性脑膜炎的“金标准”［2，35］，但培养周期较长。文献报道结核菌γ干扰素释放试验诊断结核分枝杆菌敏感度高于70%，PCR 技术诊断结核性脑膜炎敏感度为59.5%［15］。周睍等［36］对确诊为结核性脑膜炎的19 例病例脑脊液进行测序，诊断的敏感度为57.9%。《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》中建议［7］：对于结核分枝杆菌、军团菌、布鲁菌等胞内菌或厚壁菌即使检出序列不高，也要考虑此类病原菌感染的可能。目前阶段NGS技术对于胞内菌及厚壁菌检出率不高，是由于此类细菌的核酸有厚荚膜或不易从脑脊液中被提取出来，如何有效提取此类细菌的核酸是影响NGS敏感度的重大阻碍［37］。

4.3 脑脊液病原菌特异度有待提高Glaser等［27］研究发现，在脑脊液NGS 测序结果中存在一些常见的细菌序列，如丙酸痤疮杆菌、不动杆菌等。由于标本取材的特殊性，脑脊液或脑组织标本一直存在环境或标本中有被微生物污染的风险，一旦微生物混入其中就会导致检验结果出现一些无法解释的序列，所以必须提高取材人员以及实验室检测人员的技术并优化实验步骤［37］。

4.4 数据组文库仍需进一步扩充统计显示目前已经纳入NGS基因文库的病原体有8 000多种，其中包括3 000余种细菌，4 000余种病毒，200余种真菌和140种寄生虫［7］。由于NGS技术问世时间尚短，目前仍有很多微生物尚未被人类发现，因此必须进一步扩充基因组文库。随着更多罕见或未知病原体的发现，可以更全面地分析NGS 结果。另外NGS 平台较多，采取的标准及数据库差异较大，因此需要构建出统一的数据库标准，从而缩小不同平台间数据库之间的差距。这将有助于新发感染性疾病的快速诊断，以及更好的评价菌株分型和耐药基因型，从而为临床诊治工作提供更好帮助。

5 NGS技术的前景

目前世界步入百年未有之大变局，新型冠状病毒疫情暴发加速这一大变局，人们开始越来越重视感染性疾病。传统的微生物检测方法虽然技术成熟且稳定，但存在检测周期长且操作复杂的缺陷。当今全球感染性疾病爆发大环境之下，传统检测技术的不足愈发明显，在疾病的防治过程之中，准确、快速的诊断至关重要。统计资料显示2016—2020 年，传染病报告死亡数逐年上升，2016 年死亡数为18 237 例［37］，2020 年死亡数为26 374 例。中国感染性疾病的诊疗水平在世界上属偏低，且与发达国家之间仍有很大差距，快速检验技术的广泛应用有希望缩小我们与发达国家之间的差距。NGS技术作为一种新兴的检测技术，还有很大探索空间，其不需要分离培养且有准确性好的特点。NGS 技术的广泛应用，将会优化检测步骤并且制定一套规范化的检验流程，从而提高病原体的检出率。相信随着技术的进一步发展，NGS的成本会越来越低，同时也会越来越普及。

NGS技术在中枢神经系统感染性疾病的诊断中有极大的发展前景，其高通量、准确性高的特点可以弥补传统病原体检测方法的不足。但该技术步入临床时间较短，仍有较大的发展空间，针对一些特定病原体检出率不高，其检测成本仍然较高。临床工作中，仍需将临床表现、影像学检查、传统实验室检测方法与NGS相结合，进行综合分析［36］。

随着人们对基因体信息认识的进一步提高，技术的革新以及文库不断的扩充，NGS 技术将在临床中发挥更大的作用，尤其是当大量的数据被挖掘后，有可能发现一些颠覆传统认知的发现。因此，现阶段进行多中心大样本的NGS 研究很有必要，不仅能够推动抗生素精准治疗以及加深人们对感染性病原体的认识，还可以使患者能够得到更及时、更准确治疗。相信在不久的将来，NGS 技术将成为临床中诊断感染性疾病的有利工具。