海洋产几丁质酶菌株Stenotrophomonas nitritireducens CZW003的筛选、鉴定及酶学特性研究

赵倩，丁志雯，钱亮亮，李甜，黄志发，房耀维，刘姝*

(1.江苏海洋大学 食品科学与工程学院，江苏 连云港 222005；2.连云港市质量技术综合检验检测中心，江苏 连云港 222005)

几丁质(chitin)又名甲壳素，由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的线性链组成，并由氢键紧密连接，是广泛存在于自然界中的一种含氮多糖类生物性高分子，在海洋中尤为丰富，是海洋生物N和C的能量来源[1]。部分海产品加工副产物中含有大量的甲壳素，因其难溶于水及普通溶剂，常被当作废物丢弃，导致环境污染[2—4]。而几丁质的水解产物几丁寡糖广泛应用于农业、工业、医学和食品等多个领域，具有抗真菌、杀虫、抗疟疾、抗癌、降血脂和提高食品质量等特性[5]。

目前，制备几丁寡糖的方法主要有化学法、物理法和生物酶法。几丁质酶催化制备几丁寡糖的生物酶方法绿色、安全、高效[6—7]。不仅减少了环境污染，而且降低了工业成本。几丁质酶是一种专一催化几丁质生成几丁寡糖的酶。细菌、真菌和病毒等微生物，以及植物、昆虫和哺乳动物都可产生几丁质酶[8—9]。其中，由于微生物几丁质酶易于生产制备的优势，因而逐渐成为研究热点。已报道有超70种微生物可分泌出几丁质酶，海洋微生物蕴藏巨大潜力，如Clonostachysrosea[10]，Pseudoalteromonassp.DL-6[11]，Paenicibacillusbarengoltzii[12]，Moritellamarina等[13]来自海洋微生物，具有较强的分泌几丁质酶的能力。

工业上大多采用强酸进行甲壳素的预处理以及后续的低温发酵，因此如能挖掘出低温耐酸的几丁质酶产生菌，在工业化应用上具有明显优势。与环境来源的几丁质酶相比，从海洋微生物来源的几丁质酶，易培养，pH和温度范围较广[14]。但目前，海洋几丁质酶报道中多在偏碱性条件下具有最大活性及稳定性，例如海洋细菌Bacillussp. R2产几丁质酶最适pH为7.5，在pH 7.0～8.0之间具备很好的稳定性[15]；Pseudoalteromonassp. DC14产几丁质酶最适pH为9.0， 在pH 8.0～11.0之间保持较好的稳定性等[16]；而在酸性环境下表现出最佳活性及稳定性鲜少报道。本实验从海泥中筛选并鉴定菌株CZW003为Stenotrophomonasnitritireducens(还原亚硝酸盐寡养单胞菌)，目前关于海洋来源的S.nitritireducens产几丁质酶尚无报道，通过研究其产几丁质酶的酶学特性，为低温耐酸几丁质酶的深入研究提供了实验基础，也为制备几丁寡糖提供了新颖酶源。

1 材料与方法

1.1 样品采集

连云港市风景区连岛海域的海泥，置于便携冷藏保温箱中带回实验室。

1.2 海洋微生物培养基

富集培养基：10 g粉状几丁质、0.5 g MgSO4·7H2O、0.3 g KH2PO4、0.7 g K2HPO4、0.01 g ZnSO4、0.01 g FeSO4·7H2O、1 L陈海水，调配至pH 7.0。

筛选培养基：20 g琼脂、10 g硫酸铵、10 g胶体几丁质、0.3 g KH2PO4、0.7 g K2HPO4、1.5 g MgSO4·7H2O、1 L陈海水，调配至pH 7.0。

种子培养基：10 g蛋白胨、5 g酵母粉、1 L陈海水，调配至pH 7.0。

发酵培养基：10 g粉状几丁质、5 g 蛋白胨、10 g葡萄糖、0.3 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、1 L陈海水，调配至pH 7.0。

1.3 仪器设备

LRHS-250B智能型恒温恒湿培养箱 上海贺德实验设备有限公司；HS-F16/3离心机 德国赛默飞世尔公司；E200生物显微镜 Nikon公司；T100 PCR仪 伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 产几丁质酶菌株的筛选

用分析天平称取1 g海泥试样于50 mL富集培养基中，设定温度30 ℃、转速200 r/min恒温摇床，培养48～120 h。取富集后的样液进行梯度稀释，分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，并各取0.05 mL均匀涂布于两个平板，倒置培养在35 ℃恒温培养箱中4～6 d，每天观察直至菌落出现透明圈，有透明圈的菌落即为产几丁质酶，挑选透明圈清晰且最大的菌落，用三区划线方法进行纯化培养24～72 h，观察直至出现单菌落。

1.4.2 菌株CZW003的鉴定

依照文献[17]对纯化培养的菌株CZW003进行菌落、细胞形态学和革兰氏染色特征观察，并对其生理生化特征进行测定。提取菌株CZW003的总DNA进行16S rDNA扩增。PCR细菌通用引物：27F：5′-AGA-GTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCT-TGTTACGACTT-3′。PCR反应体系(50 μL)：Template DNA(1 μL)；上游引物27F(1 μL)；下游引物1492R(1 μL)；Premix(25 μL)；ddH2O(22 μL)。PCR反应流程：94 ℃预变性5 min，不循环；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃终延伸8 min，不循环；PCR扩增产物于4 ℃冷藏保存。基因序列寄送南京思普金生物科技有限公司测定，将测序结果上传GenBank，用BLAST与数据库中所有核糖序列进行种属同源性比对，挑选同源性相近的菌株，用MEGA 7.0构建分子进化树。

1.4.3 胶体几丁质的制备

参照陈茜文等[18]的方法制备胶体几丁质。称取20 g粉状几丁质缓慢倒入200 mL浓HCl中，再加入200 mL蒸馏水，并用磁力搅拌器不断搅拌12 h后，倒入2 L、4 ℃的95%乙醇中，混匀后放室温静置12 h，设置离心机4 ℃、5 000 r/min离心20 min，将沉淀物加蒸馏水反复冲洗至中性，最终用蒸馏水定容至1 L，置于4 ℃保存，备用。

1.4.4 酶活的测定

参考常国炜等[19]的研究方法制备DNS试剂，并用DNS法测定还原糖含量[20]。称取100.00 mg葡萄糖标准品，用蒸馏水定容至100.00 mL，配制成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，将其稀释成5个不同浓度的葡萄糖标准溶液，并且设空白对照，加入DNS试剂煮沸5 min显色，测定540 nm处的吸光值并绘制葡萄糖标准曲线。用移液枪取100 μL粗酶液与900 μL 1%的胶体几丁质，于35 ℃水浴30 min，再加入1.5 mL DNS试剂煮沸5 min显色，离心取上清液，在540 nm处测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。酶活力单位(U)：在最适条件下，每分钟生成1 μmol还原糖所消耗的酶量定义为一个酶活力单位。相对酶活(%)：酶在各组不同条件下酶活性相对最高酶活性的百分比。

1.4.5 酶学特性研究

1.4.5.1 酶最适温度及其稳定性

设定5～65 ℃不同反应温度，分别测定不同温度下的酶活力；将上述不同温度条件下的酶保温0.5，1，1.5，2，2.5，3 h后，再分别测定酶活力。将每组的最高酶活设为100%，其他各组为相对酶活，探究酶最适温度及其稳定性情况。每组设计3次平行实验。

1.4.5.2 酶最适pH及其稳定性

调配pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0不同梯度的磷酸盐缓冲液后，加入粗酶液与底物，一并于30 ℃恒温水浴锅中保育，分别测定不同pH条件下的酶活力；将上述不同pH值的混合液在30 ℃恒温水浴锅中继续放置12 h后，再分别测定其酶活力。将最高酶活的一组设为100%，其他各组为相对酶活，探究酶最适pH及其稳定性情况。每组设计3次平行实验。

1.4.5.3 金属阳离子和EDTA对酶活的影响

以1%胶体几丁质为底物，向粗酶液中分别加入含Mg2+、Na+、Hg+、Co2+、Fe2+、Ca2+、Ag+、Zn2+、K+的金属阳离子溶液以及EDTA，浓度均为1 mmol/L，再分别测酶活。以只加入蒸馏水的酶液酶活为100%，其他各组为相对酶活，探究金属阳离子对酶活的影响。

1.4.5.4 底物特异性

分别选择粉状几丁质、壳聚糖、胶体几丁质作为底物，与粗酶液进行反应，按照质量体积比0.5%形成反应体系，在其最适条件下测定酶活。

2 结果与分析

2.1 产几丁质酶菌株的筛选

将富集培养基上的海泥样品梯度稀释涂布于筛选培养基上，通过透明圈法挑取透明圈明显且较大的菌株共4株，透明圈最大的命名为CZW003，见图1。将其单菌落用接种环移至种子培养基中培养后，再以1%的接种量接种到发酵培养基中，设定30 ℃、200 r/min条件下培养72 h后再离心，取上清液进行酶活的测定，得出酶活为16.91 U/L。

图1 平板透明圈Fig.1 Plate transparent zone

2.2 菌株CZW003的鉴定

2.2.1 菌株CZW003的形态学特征

菌株CZW003的形态学观察见图2。

图2 菌株CZW003的形态学特征Fig.2 Morphological characteristics of strain CZW003

由图2中a可知，通过革兰氏染色观察，此菌株为革兰氏阴性菌，无芽孢，短杆状。在筛选培养基上菌落呈现的形态：菌落较小呈浅黄色，表面光滑湿润，有黏性，不透明，微凸易挑取(见图2中b)。

2.2.2 生理生化特征

对菌株CZW003进行16项生理生化特征测定。其中β-半乳糖苷酶、氧化酶、VP反应和明胶水解均为阳性，吲哚试验、脲酶和产生H2S均为阴性，具体测定结果见表1。根据形态学和生理生化特征初步鉴定为S.nitritireducens。

表1 菌株CZW003的生理生化试验结果Table 1 Physiological and biochemical test results of strain CZW003

2.2.3 菌株CZW003的16S rDNA扩增与分析

将菌株CZW003的DNA作为模板DNA进行16S rDNA扩增，PCR产物测序结果序列上传GenBank(登录号：MW435380)，用BLAST与数据库中所有核糖序列进行种属同源性比对，发现该菌株与Stenotrophomonasnitritireducens(登录号NR 025305.1)的同源性最高，一致性达到96%，从中选择亲缘关系相近的菌株，用MEGA 7.0软件构建分子进化树(见图3)，做比对分析得出菌株CZW003与S.nitritireducens在同一支且亲缘关系最近，因此将菌株CZW003鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的还原亚硝酸盐寡养单胞菌。

图3 菌株CZW003的分子进化树Fig.3 Molecular evolutionary tree of strain CZW003

2.2.4 标准曲线的绘制

用DNS法绘制菌株CZW003几丁质酶酶活的葡萄糖标准曲线，见图4。得到线性方程y=2.328 4x-0.004 4，相关系数R2=0.999 4，契合度较高。

图4 葡萄糖标准曲线Fig.4 Standard curve of glucose

2.3 酶学特性研究

2.3.1 酶的最适温度

在设定的不同温度条件下，测定其酶活力。由图5可知，温度在35 ℃时酶活力最高，并设为酶活100%，在35～65 ℃之间酶活呈急剧下降趋势，随着温度升高，酶逐渐变性失活；相比之下，在5～35 ℃之间酶活的下降趋势较为缓慢，在15 ℃时相对酶活达到60%以上，且在5 ℃仍有催化活性，说明该酶具有较强的冷适应性。

图5 温度对菌株CZW003产几丁质酶的酶活影响Fig.5 Effect of temperature on the enzyme activity of chitinase produced by strain CZW003

2.3.2 温度对酶活稳定性的影响

图6 温度对酶活稳定性的影响Fig.6 Effect of temperature on the stability of enzyme activity

将菌株CZW003在6个不同温度环境下同时放置在恒温水浴锅中，分别将6个不同温度的初始酶活设为100%，每间隔0.5 h分别测定其酶活力，并计算其相对酶活。由图6可知，菌株CZW003在温度5～35 ℃下，酶活变化较稳定，尤其在5 ℃和15 ℃温度下水浴保温3 h后相对酶活仍能保持在70%以上，在55 ℃水浴1 h后酶活急剧下降，3 h后已低至20%以下，说明该酶在低于35 ℃下具有良好的酶活稳定性。

2.3.3 酶的最适pH

图7 pH对菌株CZW003产几丁质酶酶活的影响Fig.7 Effect of pH on the enzyme activity of chitinase produced by strain CZW003

设定pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，测定其酶活力。由图7可知，当pH为6.0时，酶活力最高并设为酶活100%，当pH为5.0时，酶活仍达到90%以上。而当pH>8.0时，酶活迅速降低，这是因为pH过高破坏酶蛋白的空间结构，使酶受到不可逆的破坏，可见该酶最适pH为6.0。

2.3.4 pH对酶活稳定性的影响

图8 pH对酶活稳定性的影响Fig.8 Effect of pH on the stability of enzyme activity

将不同pH值的混合液在30 ℃恒温水浴锅中继续放置12 h后，再分别测定其酶活力。由图8可知，在混合液pH值为6.0时，酶活力最高并设为酶活100%。pH在 3.0～7.0酸性条件下，保温12 h仍保持相对稳定的酶活性，特别在pH 5.0和pH 3.0时，相对酶活分别保持在95%和80%以上，可见该酶是耐酸几丁质酶。

2.3.5 金属阳离子和EDTA对酶活的影响

向粗酶液中加入不同的金属阳离子和EDTA，并分别测定酶活力，将只加入蒸馏水的酶活设为100%，结果见图9。

图9 金属阳离子及EDTA对酶活的影响Fig.9 Effect of metal cations and EDTA on the enzyme activity

Mg2+、Ca2+、K+对酶活具有激活作用，而Hg+、Fe2+、Ag+及EDTA对酶活具有明显的抑制作用。

2.3.6 底物对酶活的影响

因几丁质酶为底物诱导酶，所以分别选择粉状几丁质、壳聚糖、胶体几丁质作为底物，与粗酶液进行反应，CZW003对不同底物的降解能力见图10。

图10 底物对酶活的影响Fig.10 Effect of substrates on the enzyme activity

由图10可知，该酶有严格的底物特异性，对胶体几丁质的酶解能力显著，而粉状几丁质与壳聚糖的酶解能力很弱。

3 结论

本实验研究的样品来自连云港市风景区连岛海域的海泥，从中筛选出一株产几丁质酶的菌株CZW003，经形态学特征、生理生化试验及16S rDNA序列扩增分析，鉴定该菌株为S.nitritireducens。菌株CZW003产几丁质酶的最适温度为35 ℃，在低温5 ℃下仍具有催化活性，在5～35 ℃之间具有较好的稳定性；该酶的最适pH为6.0，在pH 3.0～7.0酸性条件下保持较强的酶活力，相对酶活达到80%以上；金属阳离子Mg2+、Ca2+、K+对该酶酶活具有促进作用，而Hg+、Fe2+、Ag+及EDTA对酶活具有明显的抑制作用，用胶体几丁质作为底物时酶活力最高。由实验结果可知，该酶属于低温耐酸几丁质酶，能在低温和酸性环境中发挥更好的作用，有利于严酷的工业发酵条件。该酶的独特酶学特性为其进一步开发与应用提供了理论和实验基础。