蒸汽预处理对黑蒜品质的影响

贾庆超，宋志强

(郑州科技学院食品科学与工程学院 郑州市食品安全快速检测重点实验室，郑州 450064)

大蒜是葱科葱属植物中一种十分有效的功能性食品原料[1]，性温味辛，常被人们誉为“天然的抗生素”，医学研究表明[2]，大蒜在心血管疾病、感染性疾病、肿瘤及糖尿病等的预防与治疗方面具有活性作用。然而，其辛辣的味道和特有的气味让很多人望而生却，尤其是未加工的生大蒜。黑蒜又称为发酵黑蒜，是在不添加任何添加剂的情况下，通过控制温度对整个大蒜进行数天发酵生产而成[3-4]，大蒜颜色在发酵过程中逐渐从白色或黄色变为深棕色[5]，主要发生非酶褐变、酚类氧化和多糖解聚等化学反应[6-7]，发酵过程的热量加速了高分子量多糖降解为低分子量低聚糖和单糖，从而转化为水溶性生物活性化合物，如S-烯丙基半胱氨酸、生物碱、多酚和类黄酮化合物，这些化合物与黑蒜的抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗过敏和降血脂等保健功能有关，黑蒜的这些具有保健功能的物质取决于其加工的工艺条件[8]。研究表明[9]，预处理工艺可以改变黑蒜保健功能的活性物质。一般来说，高温会破坏大蒜基质中的细胞结构，促使黑蒜在发酵过程中物质的释放进而相互反应。蒸汽处理是水果和蔬菜加工中使用的一种常见的热处理方法，它通过果胶多糖的解聚导致细胞膜损坏[10-11]，就加工时间和黑蒜的特性而言，蒸汽预处理工艺可能是提高黑蒜产品加工效率的一种简单替代技术。本研究的目的是研究蒸汽预处理工艺对黑蒜品质的影响，主要研究了不同蒸汽预处理时间制备的黑蒜的一些性能指标和抗氧化活性，为黑蒜的发展研究提供了有力的数据参考和支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜大蒜：市购；EDTA-2Na、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、焦性没食子酸、没食子酸、无水乙醇、氯化铁、硫酸亚铁、邻二氮菲、双氧水、邻苯三酚：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水碳酸钠：郑州派尼化学试剂厂；苯酚、巴比妥酸：上海展云化工有限公司；浓硫酸、浓盐酸：洛阳昊华化学试剂有限公司；蔗糖：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；铁氰化钾、浓盐酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、亚硝酸钠：郑州市德众化学试剂厂；Tris、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、茚三酮、福林酚(1 mol/L)：福州飞净生物科技有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1004 Bsartorius电子天平 赛多利斯公司；PXSJ-216离子分析仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；恒温发酵箱 上海科恒实业发展有限公司；Anke TDL-50B离心机 上海安亭科学仪器厂；电热恒温水温箱、电子万用炉 北京市永光明医疗仪器有限公司；KQ5200B机械型超声波清洗仪 上海合金超声设备有限公司；UV-4802H紫外分光光度计 尤尼柯仪器有限公司；CR-400 型色差仪 日本Minolta公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大蒜的蒸汽预处理

首先选取新鲜大蒜去皮、去根蒂清洗，将蒸汽锅内水烧开5 min，使汽蒸锅内的蒸汽达到饱和，将清洗过的大蒜瓣迅速放在蒸锅的篦子上，进行蒸汽预处理。预处理时间分别为3，5 min(以下分别简写为PT3、PT5)，将处理好的蒜瓣于室温下，通风橱中干燥1 h，同时和未进行任何处理的大蒜(以下简写为PN)，一起用于制备黑蒜。

1.3.2 黑蒜的制备

根据赵雪晴等[12]和Zhang等的研究，将预处理好的大蒜PT3、PT5和未进行预处理的大蒜PN放入发酵箱内，保持湿度不变，设定发酵温度为70 ℃，进行发酵，每隔2 d定量取出发酵的黑蒜进行指标测定，发酵的总时间为18 d。

1.3.3 褐变程度的测定

根据Li等[13]的方法，使用色差计测量色度。在色差计中，样品的颜色由3个维度L*、a*和b*表示。L*值(反射率)衡量产品对光的反射，范围从完美白色的 100 到黑色的 0。红色/绿色和黄色/蓝色分别用a*和b*值表示。色差计在测量前使用白色和黑色标准进行校准。褐变程度以ΔE表示：

ΔE=[(L*-L0)2+(a*-a0)2+(b*-b0)2]1/2。

式中：L*、a*、b*分别为色差计的测定值；L0、a0、b0分别为未进行任何处理的大蒜的测定值。

1.3.4 水分含量的测定

采用GB 5009.3—2016中的第一法直接干燥法对水分含量进行测定，干燥温度为60～65 ℃。

1.3.5 氨基酸-N含量的测定

采用电位滴定法进行氨基酸-N含量的测定。

1.3.6 总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法[14-15]测定总酚含量。在760 nm下测定吸光度，没食子酸标准曲线为Y=94.893X+0.009 6，R2=0.999 6。

1.3.7 还原糖含量的测定

采用DNS法[16](3,5-二硝基水杨酸显色法)测定还原糖含量，在494 nm处测定吸光度，葡萄糖标准曲线为Y=0.006 2X—0.002 1，R2=0.999 5。

1.3.8 5-HMF(5-羟甲基糠醛)含量的测定

采用李良等[17]和Li等的方法进行测定。

1.3.9 总黄酮含量的测定

参考郑清等[18]、赵晓娟等[19]的方法，配制0.2 mg/mL的芦丁溶液，分别取0，1，2，3，4，5 mL，用亚硝酸钠-硝酸铝显色法处理，在510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线为：Y=1.986 3X—0.002 8，R2=0.999 2。黄酮含量计算公式为：

式中：X为黄酮含量(mg/g)；C为根据标准曲线求得的质量浓度(mg/mL)；V为所取液体的体积(mL)；A为所取待测液的稀释倍数；B为黑蒜粉末质量(g)。

1.3.10 总酸含量的测定

参考加雪梅[20]的方法进行总酸含量的测定。

1.3.11 DPPH·、·OH清除率的测定

参考赵晓娟等的DPPH·、·OH清除活性测定方法，进行抗氧化性的测定。

1.3.12 发酵终点的判断

结合黑蒜的企业标准Q/LYY 0001S-2010、Q/SJC 0001S-2010、Q/STY 0001S-2013、Q/SHD 0001S-2011等，参考赵雪晴等的研究结果，黑蒜的发酵标准制定为：水分含量(g/100 g)≤40，还原糖含量(g/100 g)≥25，总酚含量(mg/g)≥8，5-HMF(mg/g)≤13.0，氨基酸-N含量(g/100 g)≥5.0。

2 结果与分析

2.1 黑蒜的褐变程度

图1 褐变程度Fig.1 Browning degree

ΔE的大小意味着黑蒜颜色的深浅，ΔE值越大，大蒜的褐变程度越大，黑蒜的颜色越深[21]。由图1可知，PT3和PT5的ΔE在发酵18 d内均比未处理的大蒜的ΔE要大，说明蒸汽处理可以促进美拉德反应的发生，促进黑蒜更快发酵。PT3和PT5的ΔE分别在发酵第10天和第12天基本趋于稳定，说明这时候黑蒜基本发酵形成。另外，PT3和PT5的褐变程度均大于PN，Nugrahedi和Li等指出，蒸前处理可能通过破坏细胞壁和细胞结构来诱发黑蒜的发黑，大蒜中还原糖、氨基酸-N含量、酚类化合物等成分更加容易释放出来，促进美拉德褐变反应的发生。PT3的ΔE大于PT5，Fante等[22]指出可能是由于PT5促使多酚氧化酶(PPO)失活，从而不利于美拉德反应的发生，而PT3则不足以使大蒜PPO活性完全失活，以上说明3 min的蒸汽预处理时间比较适宜。

2.2 水分含量

由图2可知，3种条件下的大蒜在发酵过程中水分含量均呈现下降的趋势，尤其是PT3水分含量下降得更加明显一些，说明PT3美拉德反应更加强烈。根据1.3.12中黑蒜指标的要求，在发酵第18天时，由未处理大蒜发酵制备的黑蒜的水分含量才符合黑蒜的指标要求，PT3和PT5在第6天、第10天就已经符合要求，说明蒸汽预处理可以大大缩短黑蒜发酵所需的时间，节约时间成本，且在第18天时，水分含量PT3

图2 水分含量Fig.2 Moisture content

2.3 还原糖含量

在黑蒜加工过程中，黑蒜中的还原糖含量取决于两个因素：一是大蒜中的多糖被降解为还原糖，二是还原糖在美拉德反应过程中被消耗，黑蒜中还原糖含量的变化是二者共同作用的结果。由图3可知，在黑蒜的发酵前期，PT3、PT5和PN均呈现上升的趋势，是由于多糖的降解生成还原糖的速率大于美拉德反应消耗还原糖的速率，而后期还原糖含量下降则是美拉德反应的速率大于多糖的降解速率所致。在黑蒜发酵18 d内，PT3、PT5的还原糖含量均比PN的还原糖含量高一些，尤其是对于PT3、PT5，还原糖含量分别在第12天和第10天达到最大值，分别为60.18 g/100 g和61.36 g/100 g，而此时PN的还原糖含量为47.11 g/100 g和48.29 g/100 g，均增大了25%左右，说明蒸汽预处理可以破坏大蒜的细胞壁和细胞结构，促使还原糖更好地释放出来。

图3 还原糖含量Fig.3 Reducing sugar content

2.4 5-HMF含量

5-HMF 主要通过美拉德反应和糖类脱水形成[23]，是美拉德反应的中间产物，味道略苦，它的积累与黑蒜的甜味有关。由图4可知，在发酵过程中，5-HMF的含量逐渐增加，且PN>PT5>PT3，说明蒸汽预处理可以降低5-HMF的含量，增加所加工的黑蒜的甜度。王聪聪等[24]指出，pH值是影响5-HMF的重要因素，在黑蒜的加工过程中，酸性条件有利于5-HMF的生成，碱性条件则抑制5-HMF的生成。在黑蒜的加工过程中，PN的pH值较小，一定程度上加速了5-HMF的生成。另外，还原糖的含量也是影响5-HMF的重要条件，PT3和PT5分别在发酵第12天和第10天还原糖含量出现最大值，5-HMF的含量随后也出现较大程度的增长。

图4 5-HMF含量

2.5 氨基酸-N含量

氨基酸是美拉德反应的重要底物，其含量直接影响黑蒜的品质，主要取决于两个因素：一是美拉德反应的消耗，二是大蒜在加工过程中蛋白质的分解。由图5可知，随着黑蒜加工时间的增加，蛋白质的生成量大于美拉德反应的消耗量[25]，且大蒜发酵过程中水分减少，均促使氨基酸-N含量上升。后来由于美拉德反应的消耗量大于蛋白质的分解生成量，使其呈现减小的趋势。另外，氨基酸也可与 5-HMF 发生美拉德反应[26-27]，从而减少5-HMF 的积累，增加黑蒜的风味。从发酵的第10天开始，氨基酸-N含量均小于PN，大蒜加工结束后，蒸汽预处理的大蒜氨基酸-N含量比PN分别降低了27.56%和20.10%。美拉德反应在黑蒜加工中很重要，褐变程度反映了美拉德反应的速度。在同一加工时间下蒸汽预处理大蒜的褐变程度明显大于PN，因此蒸汽预处理大蒜对氨基酸-N的消耗量高于PN。

图5 氨基酸-N含量Fig.5 Amino acid-N content

2.6 总黄酮和总酚含量

黄酮类和酚类化合物结构复杂，广泛存在于自然界动物和植物体中，是理想的天然抗氧化剂[28]。由图6可知，随着发酵时间的增加，PT3、PT5和PN总黄酮和总酚含量均呈现增加的趋势，在发酵第10天时，PT3的总黄酮和总酚含量超过PN，在发酵第18天时，总黄酮和总酚含量PT3>PN>PT5，PT3的总黄酮和总酚含量相对PN分别提升了84.2%和58.7%，说明PT3有利于提升发酵黑蒜的黄酮和酚类化合物的含量，增强发酵黑蒜的抗氧化性，而PT5不利于提升二者的含量。据报道，大蒜中的生物活性物质在发酵过程中增加，尤其是多酚和类黄酮等抗氧化活性物质，这可能是由于高分子量多酚类化合物的分解，释放出新的低分子量衍生物。同时大蒜热处理可导致蒜氨酸酶失活，进而阻断γ-谷氨酰基半胱氨酸水解和氧化成细胞毒性化合物，可能有利于γ-谷氨酰基半胱氨酸在黑蒜发酵过程中转化为黄酮和酚类等功能性化合物[29]。此外，蒸汽预处理可通过破坏大蒜基质中的细胞膜而诱导一些化合物的释放，从而提高美拉德反应速率，促使黑蒜在发酵过程中生成更多的功能活性化合物[30]。

图6 总黄酮和总酚含量Fig.6 Total flavonoid and total phenol content

2.7 总酸含量

美拉德反应是一个产酸的过程，其中间产物α-二羰基化合物能够通过降解生成甲酸、乙酸等有机酸[31]。由图7可知，随着发酵时间的延长，PT3、PT5和PN总酸含量均增加，在发酵第18天时均达到最大值，且总酸含量PT3>PT5>PN，说明大蒜的蒸汽预处理可以增加黑蒜的总酸含量，其酸度增加与发酵过程中形成的褐变物质有关，此时其总酸含量均小于40 mg/g，可产生令人愉快的酸味，张晓溪等[32]关于美拉德反应研究的结果亦表明，pH值均随着美拉德反应的进行而降低，反应体系的酸度逐渐增加。综上所述，在发酵第18天时，制备的黑蒜完全符合要求，蒸汽预处理可大大缩短黑蒜的制备时间。

图7 总酸含量Fig.7 Total acid content

2.8 抗氧化性

DPPH·溶于乙醇，在517 nm波长处有最大吸光度，是一种稳定的自由基。当DPPH·遇到抗氧化性物质时，接受被测样品提供的电子或氢后，形成稳定的分子，溶液颜色减退，导致其吸光度减小。根据吸光度的大小可以判断被测样品抗氧化能力的强弱[33]。

图8 DPPH·的清除能力Fig.8 Scavenging ability of DPPH· free radicals

由图8可知，随着黑蒜发酵时间的增加，其抗氧化性逐渐增大，最大时PT3、PT5和PN三者分别达到76.3%、73.8%和55.8%，尤其是发酵8 d以后，DPPH·清除率增加的幅度更大，这与其总酚和总黄酮的变化趋势是一致的。另外，PT3的DPPH·清除率稍大于PT5，且二者均比PN大，尤其是8 d以后，PT3和PT5比PN更大一些，最大时分别相对PN增加36.3%和32.2%。以上说明PT3更有利于提升黑蒜对DPPH·的清除率，同时也说明蒸汽预处理可以提升黑蒜对DPPH·的清除率。

图9 ·OH的清除能力Fig.9 Scavenging ability of ·OH free radicals

·OH具有较强的得电子能力，会诱导DNA 链断裂和碱基改性，从而引起如癌症等一系列疾病，其产生的Fenton反应为：Fe2++H2O2→Fe3++·OH +OH-。抗氧化性的物质可以直接清除羟自由基，减少羟自由基的产生量，吸光度值降低[34]。

由图9可知，随着发酵时间的增加，PT3、PT5和PN对·OH的清除率均逐渐增大，且PT3>PT5>PN，PT3、PT5与PN之间的差距随着发酵时间的增加逐渐增大，PT3和PT5最大时分别达到53.7%和50.6%，相对PN分别增大了44.7%和36.3%。以上说明PT3更有利于提升黑蒜对·OH的清除率，同时也说明蒸汽预处理可以提升黑蒜对·OH的清除率。

Bae和Lu等指出，在一定发酵温度下，黑蒜的颜色深浅取决于其发生的美拉德、酚类氧化和多糖降解等复杂反应，这些复杂反应提供了各种各样的生物活性化合物，如美拉德反应中间物、多酚和黄酮类等化合物，这些物质对于提升黑蒜的抗氧化性是非常有利的，而其质量和数量取决于所使用的生产工艺[35-36]。综上所述，蒸汽预处理可提高黑蒜的抗氧化活性，且PT3优于PT5。为了进一步探索蒸汽预处理制备黑蒜的最佳工艺，下一步的工作重点是将蒸汽预处理的时间设置更加细致一些，比如预处理50 s、1 min、2 min等，结果值得期待。

3 结论

相对PN而言，蒸汽预处理使黑蒜的褐变程度ΔE在更短时间内趋于稳定，还原糖更加容易生成，根据黑蒜的标准，PT3形成黑蒜的时间为第10天，PT5形成黑蒜的时间为第12天，而PN形成黑蒜的时间为第18天，说明PT3是比较好的蒸汽预处理时间，此时5-HMF含量较低，总黄酮、总酚等抗氧化性物质含量较高，黑蒜具有较强的抗氧化活性，而且在更短的时间内制备出黑蒜，节约了时间成本，具有更广阔的发展空间。所以进一步研究蒸汽预处理的价值很高，同时也可以结合目前部分研究者提出的冷冻预处理，将二者预处理工艺联合也将是下一步研究的重点。