一株草原野生花脸香蘑菌种培养基的筛选研究

隋业璇 徐伟良 李春冬 郭梁

(锡林郭勒职业学院生物工程研究院，内蒙古 锡林浩特 026000)

花脸香蘑(Lepista sordida)属于担子菌亚门、伞菌纲、伞菌目、口蘑科、香蘑属，又因其菌肉呈淡紫罗兰色，又名紫晶香蘑、丁香蘑、花脸蘑等[1]。花脸香蘑广泛分布于内蒙古、东北、甘肃、河南、四川等地，多产于夏秋季节，群生或簇生于草原、山坡、林中草地，是一种开发潜力巨大的优质药食同源菌种[2,3]。紫花脸香蘑所含多糖成分可间接调节益生菌和有害菌二者的竞争关系、促进骨骼生长、降低血糖等[4]。花脸香蘑含各种氨基酸，胡先运等通过用土豆、酵母膏、蔗糖和生长因子制成的液体培养基培养后测得，花脸香蘑菌丝体富含8种人体必需氨基酸，且总氨基酸含量达51.49%，高于一些常见的真菌，如灵芝等[5]。花脸香蘑中钙、铁、胡萝卜素和烟酸含量丰富，还含有较多的微量元素，具有养血、益神和补五脏的功效，常食有利于治疗贫血、久病体虚、神疲和健忘等症，并具有抑制癌细胞的功效和广泛的抗菌活性[6,7]。宋晓琳等通过建立小鼠急性化学性肝损伤模型研究发现，花脸香蘑多糖具有一定的抗氧化作用，对氯仿(CCl4)诱发的小鼠急性肝损伤具有保护作用[8]。陈湘莲等用二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)法对从花脸香蘑分离提取的发酵次生代谢物质研究表明，菌丝提取物具有较强的抗氧化、抗肿瘤活性[9]。

目前，对于花脸香蘑的研究主要集中在生物学特性、液体发酵培养及生物活性成分，对栽培驯化的研究报道较少。罗倩等以菌丝生物量为主要指标，对1株分离的花脸香蘑HL-07菌株进行液体培养基优化，筛选出了适宜其菌丝生长的液体培养基[10]。许瀛引采用液体发酵技术获取足量的花脸香蘑菌丝体[11]。张俊波等利用谷壳、干牛粪、菜籽饼、麦麸、碳酸钙和石灰石膏制成合适出菇的栽培种[12]。孟玲等通过对碳源、氮源、碳氮比、无机盐等营养因子进行分析研究，优化了花脸香蘑菌丝体固体培养所需等生长因素配比[13]。贺永国等利用用浸泡后的麦粒、发酵好的白参菌菌糠进行实验室栽培种出菇[14]。综上所述，花脸香蘑的菌种培养基的筛选、培育与人工驯化栽培还处于实验室研究阶段，未见大规模商业化栽培。

花脸香蘑在内蒙古草原地区均匀分布，其中在锡林郭勒和呼伦贝尔草原野生菌群资源丰富，产量较多。但由于花脸香蘑缺乏科学研究及保护，人工驯化栽培技术尚未获得实质性的突破。随着生态环境的不断变化，其生境破坏严重，并由于每年生长时间短，自然采集量低，有价无货，导致野生花脸香蘑菌群分布逐渐减少，亟需对野生花脸香蘑种质资源开展研究和保护。本研究对采集于锡林郭勒草原的野生花脸香蘑子实体进行分离培养，选取常用的固体培养基、液体培养基及栽培种培养基进行人工驯化培养研究，筛选出适合花脸香蘑菌丝生长的固体培养基、液体培养基以及栽培种培养基为后续花脸香蘑的人工驯化和仿野生栽培种提供优质种质。

1 材料与方法

1.1 材料

野生花脸香蘑子实体采集于内蒙古锡林郭勒盟草原，分离鉴定菌丝体由锡林郭勒职业学院生物工程研究院提供。

1.2 培养基

1.2.1 固体培养基配方

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)：马铃薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然[15]；PDA加富培养基，g·L-1：马铃薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，琼脂20g，pH自然[16]；改良PDA培养基，g·L-1：马铃薯(去皮)切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，维生素B10.01g，琼脂20g，pH自然[17]。

1.2.2 液体培养基配方

液体培养基1，g·L-1：马铃薯切片200g，葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，KH2PO43g，MgSO41.5g，pH自然[18]；液体培养基2，g·L-1：玉米粉30g，蔗糖10g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 1.5g，pH自然[19]；液体培养基3，g·L-1：蔗糖30g，酵母膏6g，KH2PO40.1g，MgSO4·7H2O 1g，pH自然[20]。

1.2.3 栽培种培养基配方[21]

高粱1.0kg，麸皮50g，石膏50g，木屑200g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，蒸馏水根据湿度添加。

1.3 设备

SW-CJ-2D超净工作台，上海昕仪仪器仪表有限公司；HWS-250BX恒温恒湿培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；202-3A电热恒温干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；电子万用炉，北京市永光明医疗仪器有限公司；MLS-3751L-PC高温高压灭菌锅，日本SANYO公司；THZ-35高速恒温培养摇床，苏州贝茵科技股份有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 固体培养基筛选

选取朵形端正、健壮、色泽好、肉质饱满的花脸香蘑子实体，通过无菌操作将子实体纵剖，在花脸香蘑子实体上划3mm×3mm×3mm大的不同的4个位置的块状组织，用接种钩勾取置培养基中央，用封口膜封住平皿，以防失水，置于25℃恒温培养箱中进行初步的避光培养。用打孔器在初步培养后的培养基上取生长速度、颜色和大小相同的菌丝块接种至3种不同的固体培养基中进行培养，每日观察并记录，直至菌丝长至培养皿边缘。用电子万用炉将3种固体培养基内琼脂煮沸溶解，使菌丝体与琼脂分离，用无菌纱布进行过滤。将菌丝放在预先干燥称量恒重后的称量皿中，放置于80℃状态下烘干，取出后冷却称量至恒重。根据花脸香蘑菌种在3种固体培养基上的菌丝长势和菌丝干质量筛选出最优固体培养基配方。

1.4.2 液体培养基筛选

在筛选出的最优固体培养基上，选取菌丝长势、颜色相似位置，用打孔器取16个大小均一的菌块，4个菌块为1组，分别接种于100mL 3种不同液体培养基中，并放入摇床中，于150r·min-1，25℃条件下培养5d。将培养好的液体培养基中的菌丝球放在纱布上过滤，用无菌水清洗后，于80℃下烘干4h，冷却至室温称重，利用公式计算菌丝体生物量[19]。根据菌丝体生物量筛选出最优液体培养基配方。公式：

菌丝体生物量(g·L-1)=菌丝体干重/培养液体积

1.4.3 花脸香蘑菌种栽培驯化

先将高粱冲洗提前用水浸泡16h，加水煮沸至高粱粒软而不烂，沥干水分，以高粱的干重为基准，依次加入石膏、麦麸和木屑，同时按配方比例加入KH2PO4和MgSO42种营养素混合水溶液，用生石灰调pH至7左右，翻搅均匀，用组培瓶装料至瓶2/3处，瓶口覆封口膜，压紧瓶盖，121℃灭菌2h后取出，在超净工作台内冷却后，无菌操作下，将灭菌后组培瓶中的栽培基料上下翻搅均匀，将筛选出的最优液体培养基按照培养基重量的3%接种，并置于25℃的恒温箱中培养。观察并记录其生长状态、菌瓶减少的重量和菌丝吃料深度，从而评价花脸香蘑在栽培种培养基上的生长状态。

2 结果与分析

2.1 花脸香蘑菌种固体培养基的筛选结果

以PDA、PDA加富及改良PDA 3种固体培养基对分离的花脸香蘑菌丝体进行培养，连续观测记录菌丝在固体培养基上的生长状况，见图1、表1，并通过菌丝干质量和菌丝长度的统计分析筛选出最适合花脸香蘑菌种生长的固体培养基配方，结果见图2、图3。通过观察菌丝长势和测量菌丝长度发现，菌丝在3种固体培养基上均能很快萌发，菌丝茂密整齐。但随着培养时间的延长，在培养至第18天时，PDA培养基上的菌丝率先长满培养皿，而PDA加富培养基与改良PDA培养基上菌丝生长略慢，在培养至第20天时，也已全部长满培养皿，因此在3种培养基上整体长势无显著差异。

注：A表示PDA培养基；B表示PDA加富培养基；C表示改良PDA培养基。

表1 花脸香蘑菌种在3种固体培养基上的菌丝生长状况

图2 花脸香蘑菌种在3种固体培养基上的菌丝长度

通过对3种固体培养基进行菌丝干质量比较，见图3，PDA加富培养基上的菌丝干质量最大，为0.17±0.02g，其次是改良PDA培养基的菌丝干质量，为0.12±0.01g，而在PDA培养基上的菌丝干质量最小，为0.11±0.03g，由此说明，虽然在PDA培养基上的菌丝生长速度较快，且菌丝较浓密，但在PDA加富培养基上的的菌丝干质量积累较多。综合以上实验数据分析，确定PDA加富培养基为花脸香蘑菌种的最优固体培养基配方。其他研究学者，如陆欢等研究报道，花脸香蘑在PDA和含麦粒的琼脂培养基均上长势旺盛，菌丝粗壮、致密，爬壁能力较强，菌丝呈紫色或浅紫色，绒毛状[22]。

2.2 花脸香蘑菌种液体培养基的筛选结果

选用3种常见不同配料的液体培养基，并以菌丝体生物量为评价指标，对花脸香蘑最佳液体培养基进行筛选，结果见图4。由图4可知，花脸香蘑菌种在液体培养基1、液体培养基2、液体培养基3 3种液体培养基上的菌丝生物量分别为1.68±0.13g·L-1、1.58±0.10g·L-1、1.06±0.11g·L-1，其中在液体培养基1上菌丝生物量最高，液体培养基3上的菌丝生物量最小。通过菌丝体生物量的比较分析，最终确定液体培养基1为花脸香蘑菌种的最佳培养基配方。目前，花脸香蘑液体发酵技术相对成熟，主要对摇瓶发酵条件的优化研究较多，对花脸香蘑液体发酵培养的影响因素通过正交实验法探索得到最优组合。崔晓等以菌丝生物量为主要指标，通过对马铃薯、玉米粉、麸皮、葡萄糖、酵母膏含量进行配比，从这5种不同液体培养基中筛选出了适宜菌丝生长的液体培养基，其菌丝生物量达到2.209g·L-1[23]。这与本研究筛选的液体培养基1的生物量相近。

图3 花脸香蘑菌种在3种固体培养基上的菌丝干质量

图4 花脸香蘑菌种在3种液体培养基上的菌丝干质量

2.3 基于高粱培养基的花脸香蘑栽培种研制

本研究通过观察并记录花脸香蘑在栽培种培养基上的生长状态、菌瓶内有机物变化量和菌丝吃料深度，从而评价花脸香蘑菌种的栽培驯化，结果如图5、图6所示。由图5、图6可知，花脸香蘑菌丝长势在栽培种培养基上呈现先快后慢的现象，菌丝在经过2d的避光培养，瓶内已出现清晰可见萌发的菌丝团，在第8天时菌丝体已生长至培养基质的1/2，随后生长逐渐减缓，至第24天时接近长满，此时菌丝吃料深度达8.12±1.7cm，可观察到少部分紫色色素和大部分白色菌丝体。通过菌瓶重量变化曲线可知，菌瓶随着培养时间的延长重量变化量逐渐增大，这是由于菌丝体腐生生长需大量消耗有机物质，当至24d时，菌瓶重量已减少了7.81±1.83g。综上试验数据分析，花脸香蘑菌丝在高粱培养基中生长状态良好，培养基能供应其基础营养物质。

图5 花脸香蘑菌种在高粱二级种培养基中的生长状态

图6 花脸香蘑在高粱二级种培养基减少的重量

3 结论与讨论

本文通过对花脸香蘑固体培养基和液体培养基选的筛选研究表明，确定PDA加富培养基为花脸香蘑菌种的最佳固体培养基配方，培养至20d后菌丝干质量达0.17±0.02g；通过菌丝体生物量的比较分析，确定液体培养基1为花脸香蘑菌种的最佳培养基配方，其菌丝生物量为1.68±0.13g·L-1。通过观察并记录花脸香蘑在栽培种培养基上的生长状态、菌瓶内有机物变化量和菌丝吃料深度，确定花脸香蘑菌丝在高粱培养基中生长状态良好，培养基能供应其基础营养物质。本研究所选用的培养基配方均以常见食用菌培养配方为基础，并进行了初步改良，因此，所筛选花脸香蘑固体培养基、液体培养基及栽培种培养基最佳配方，只作为初步筛选阶段，后续还需对培养基中的具体营养成分比例及培养条件进行优化，进一步完善论证实验研究结果，以期为野生花脸香蘑优良菌种筛选和后续育种提供有力数据。