嗅觉受体家族2亚家族W成员3和增殖细胞核抗原在胶质瘤中的表达及相关性研究

张 昕,赵 千,王丹丹,杜 野

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121001)

胶质瘤是神经系统常见的肿瘤之一，手术是治疗的重要方法，但是近年相关研究显示术后患者复发率较高，主要与病变无明显边界及其浸润性生长的方式有关[1-2]。病变形成与多种调控基因的改变相关，尤其是增殖和迁移相关的因子[3-4]。嗅觉受体蛋白(Olfactory receptor,OR)是近年关注到的与肿瘤进展有关的因子之一，研究发现OR主要是在嗅觉的神经元中表达，对调控上皮细胞的形成和发育有一定价值。也有学者认为OR家族与高增殖性肿瘤的形成有一定关系，这可能是肿瘤发生的重要分子机制之一[5]。嗅觉受体家族2亚家族W成员3(Olfactory receptor family 2 subfamily W member 3,OR2W3)是家族中对细胞增殖作用最强的因子，也是幼稚嗅上皮组织的标志因子，不仅能调控上皮细胞的发育，还可能对部分上皮的恶性转变有一定促进作用[6-7]。本研究基于胶质瘤术后标本进行研究，观察OR2W3和增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达特征，分析其相关性，探讨其对预后的判断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2014年1月至2015年12月在锦州医科大学附属第一医院确诊为胶质瘤的患者作为观察组。病例纳入标准：首次确诊行手术治疗，并有两位病理科副主任医师以上医师复核病理切片明确诊断，符合WHO中的病理诊断标准。排除术前行放、化疗的患者。本组共73例，其中男38例，女35例，年龄43～81岁，平均(62.3±8.3)岁。收集同期因脑外伤需要行颅内减压术时切取损伤边缘的脑组织(经两位病理科副主任医师以上医师确诊为正常脑组织)标本作为对照组，共73例，其中男37例，女36例，年龄45～79岁，平均(61.6±8.0)岁。本研究经过医院伦理委员会研究并批准，患者或家属均签订知情同意书。

1.2 研究方法 应用免疫组化En Vision技术检测胶质瘤组织与正常脑组织OR2W3和PCNA蛋白表达。基于术后石蜡包埋组织进行检测，切取4 μm的切片，严格按免疫组化En Vision技术的操作步骤完成，二抗和DAB购自北京中杉金桥公司，做好质控工作。以预实验中证实显色最理想的稀释浓度(1∶150)进行正式实验。严格按操作步骤进行，设阳性对照和阴性对照，做好质控，减少人为误差。OR2W3的表达部位在肿瘤细胞的细胞质，PCNA的表达部位是肿瘤细胞的细胞核。应用二维法对OR2W3和PCNA的表达进行评价，即着色强度评分：以无着色、浅黄、黄、棕褐色分别计0、1、2、3分；阳性率评分：先在低倍镜(100倍)下观察并选择3个热点区，然后在高倍镜(200倍)计数，计算阳性肿瘤细胞数量/总肿瘤细胞数量×100%，取平均值计为平均阳性率，以平均阳性率<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别评定为0、1、2、3、4分，两者相乘，分数值范围为0～12分之间。以≤4分定阴性，>4分定阳性，计算OR2W3或PCNA的阳性率。

1.3 统计学方法 选择SPSS 17.0统计学软件进行处理。计数资料以[例(%)]表示，行卡方检验；相关分析应用Pearson相关分析；生存分析应用K-M生存分析，并应用Cox回归模型；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组OR2W3和PCNA阳性表达率比较 观察组中OR2W3和PCNA的阳性率均明显高于对照组(均P<0.05)，见表1(图1、2)。

表1 两组OR2W3和PCNA阳性率比较[例(%)]

A：胶质瘤中阳性 B：正常脑组织中阴性

A：胶质瘤中阳性 B：正常脑组织中阴性

2.2 胶质瘤不同临床病理特征中OR2W3和PCNA阳性率比较 OR2W3和PCNA阳性率在不同WHO分级和肿瘤最大径比较中差异有统计学意义(均P<0.05)，而在不同年龄、性别及有无坏死的比较中无统计学差异(均P>0.05),见表2。

表2 胶质瘤不同临床病理特征中OR2W3和PCNA表达比较 [例(%)]

2.3 胶质瘤中OR2W3和PCNA表达与患者术后生存时间的关系 纳入患者均统计术后60个月的生存时间，截止时间为2020年12月31日。随访显示术后患者生存时间为4～60个月。选择的临界值为4分，经K-M生存分析显示OR2W3(χ2=5.32，P=0.029)和PCNA(χ2=5.32，P=0.029)均与术后生存时间相关，即OR2W3和PCNA高表达者术后生存时间短。Cox回归模型显示OR2W3和PCNA的表达是胶质瘤预后的独立危险因素。见图3(表3)。

表3 Cox回归模型对胶质瘤患者的单因素生存分析

图3 胶质瘤中OR2W3(左)和PCNA(右)表达与患者术后生存时间的关系

2.4 胶质瘤中OR2W3与PCNA表达的相关性 经Pearson相关分析显示，胶质瘤中OR2W3表达与PCNA表达具有正相关性(r=0.65，P=0.029)。

3 讨 论

胶质瘤起源于神经胶质细胞，肿瘤细胞具有异型性，且随着WHO分级的增加，异型性增大[8-9]，预后差。胶质瘤是高增殖性肿瘤，病变形成中具有基因和遗传因素的改变。OR基因是在褐家鼠中发现的蛋白，在嗅觉系统形成和炎性损伤时发挥作用。OR基因在结构上具有氨基酸疏水区，N端在膜外侧，C端在膜内侧，可见到3个环状的结构域[5]。OR主要表达在幼稚发育的嗅神经上皮细胞质，近年学者发现其胚胎的上皮成份及失控性增生的上皮细胞中也有表达，即细胞的上皮细胞表达升高[10]。OR对增殖的作用及对幼稚上皮的标志作用与肿瘤形成的作用具有相似性[11-12]。Cui等[13]通过检测OR51E1在神经内分泌癌中的表达，发现OR51E1的表达升高，且其与病变的进展相关，并发现其与SLC18A1具有相关性，干扰其表达可能是治疗的潜在靶点。Guo等[14]在胃腺癌中发现OR3A4基因表达升高，且与淋巴结转移相关，研究认为其可能是转移的促进蛋白。也有研究认为家族中的成员OR7C1可能是结肠癌干细胞的标志物，OR7C1阳性的结肠癌细胞系的增殖作用更强，永生化作用更明显[15]。OR2W3是家族中的重要成员，有学者发现OR2W3与胰腺癌进展有关，并在胰腺癌患者不同生物学行为的表达中差异有统计学意义，并认为OR2W3可能是细胞形成中干细胞的标记物之一[7]。因此基于OR2W3在肿瘤性病变的形成和进展中成为研究热点，由于胶质瘤疾病的进展快，发展迅速，其肿瘤成份较为幼稚，细胞异型性明显，趋于干细胞的幼稚的特征，OR2W3在胶质瘤中的表达特征可能代表着一类具有明显幼稚性肿瘤的形态特征。

本实验发现OR2W3和PCNA在胶质瘤术后组织中高表达，提示OR2W3和PCNA是促进胶质瘤形成的重要分子因素，OR2W3与神经起源的干细胞的作用及癌基因的作用相似，对细胞增生和繁殖有重要促进作用。实验发现OR2W3和PCNA与肿瘤的病变分级有关，提示OR2W3和PCNA参与肿瘤的进展。OR2W3和PCNA在肿瘤不同增殖指数和肿瘤最大径的分组中差异有统计学意义，提示OR2W3和PCNA对肿瘤生长有促进作用。研究显示胶质瘤中OR2W3和PCNA具有正相关性，提示OR2W3对肿瘤进展的作用与OR2W3对增殖的促进作用有关。OR2W3可能具有SOX、Furin、整合素相关因子和基质金属蛋白酶等[16]的激活序列，促进肿瘤细胞间质网状纤维的形成。研究认为OR2W3可能具有底物特异性，调节肿瘤细胞的失控性增生及局部浸润性生长。OR2W3可能是上皮间质转化的促进因子，这是促进肿瘤细胞迁移的重要因素[17]。本实验发现OR2W3和PCNA与术后生存时间有关，提示OR2W3和PCNA对判断预后有价值，但是这需要后续实验中进行大样本量观察随访进一步明确。OR2W3高表达还可能引起血管内皮细胞的增殖，为肿瘤细胞的生长提供必要的氧和营养。OR2W3具有干细胞的特征，参与细胞由幼稚向成熟的过程，因此胶质瘤中强表达的常为原始幼稚的干细胞，其具有多向分化潜能，也具有明显的恶性转化现象。OR2W3能使细胞“永生化”，呈持续增殖的状态。OR2W3参与Fos和c-Jun组成的转录活化因子二聚体的形成[15]。肿瘤间质中成纤维细胞的增生与OR2W3高表达有关，与促间质形成的因子共同作用，促进肿瘤细胞的侵袭和进展[18-20]。

综上所述，OR2W3和PCNA在胶质瘤中高表达，两者具有正相关性，且术后检测OR2W3和PCNA的表达与预后有关。但是由于OR2W3是近年关注到因子，认识较为浅显，尤其是其活化后的上游和下游因子的调控网络是后续实验中要关注的问题。