正红菇多酚的提取及抗氧化性能研究*

李科鹏，冯玉会，普开仙，李锐扬，戴应淑，师 伟，李 琛

(1 玉溪师范学院化学生物与环境学院，云南 玉溪 653100；2 玉溪师范学院物理与电子工程学院，云南 玉溪 653100)

正红菇(Russulavinosalinolbl)又名大红菇、红椎菌，为天然野生高等真菌，隶属于担子菌门，伞菌亚门，层菌纲，伞菌目，红菇科，红菇属，红菇属种类繁多，目前世界发现约有750种，中国发现约有158种，部分可以食用[1-2]。正红菇具有降低血糖、调节血脂、治疗贫血、抗肿瘤、抗炎、保肝等药理功能[2-4]，含有蛋白质、多糖、脂肪酸、甾醇、萜类、有机酸、多酚、色素等多种生理活性成分[5-8]，其中多酚具有清除自由基即抗氧化的能力。本文采用超声波辅助法提取正红菇中的多酚，通过DPPH自由基清除实验研究正红菇多酚的抗氧化活性，为进一步开发利用该食用菌资源提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

野生正红菇，产自福建；无水乙醇(AR)，国药集团化学试剂有限公司；超纯水，实验室自制；碳酸钠(AR)，四川西陇化工有限公司；3,4,5-三羟基苯甲酸(没食子酸)(AR)，上海安谱实验科技股份有限公司；福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(AR)，合肥博美生物科技有限责任公司。

1.2 供试仪器

DFY-500C摇摆式高速粉碎机，温岭市林大机械有限公司；TG16-WS台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JJ224BC电子分析天平，常熟市双杰测试仪器厂；SK3200HP功率可调台式超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；UV-2700紫外可见分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；OSB-2100水油两用浴锅，上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 没食子酸标准曲线的绘制

分别量取质量浓度为100 μg·L-1的没食子酸标准溶液0.00、0.15、0.35、0.55、0.75、0.95、1.15、1.35 mL于25 mL比色管中，加入15.00 mL的超纯水，0.30 mL的福林酚溶液，室温暗处静置10 min，再加入2.00 mL碳酸钠溶液，转移至25 mL容量瓶，定容，摇匀后避光静置1.0 h，于波长760 nm处测其吸光度。以吸光度为纵坐标，没食子酸浓度为横坐标，绘制标准曲线[9]。

1.3.2 正红菇多酚含量的测定

将野生正红菇干燥样品，烘干、粉碎、过60目筛，密封保存，备用。在液料比20∶1、乙醇体积分数50%、超声温度40 ℃的条件下超声40 min得到提取液，分别探究液料比、乙醇体积分数、超声温度和超声时间对正红菇多酚含量的影响。准确移取提取液1.00 mL作为待测样品，按1.3.1进行吸光度的测定，根据标准曲线可求得正红菇多酚含量[10]，具体计算见公式(1)。

(1)

式中：C为正红菇提取液中多酚的含量，mg/mL；V为所测溶液总体积，mL；N为稀释倍数；m为正红菇粉末质量，g。

1.3.3 响应面优化实验

在单因素实验基础上，利用Design-Expert 8.0软件进行响应面优化设计，以多酚提取量为响应值，以液料比(A)、乙醇体积分数(B)、超声温度(C)、超声时间(D)为因变量，设计四因素三水平响应面分析实验[8]，对正红菇多酚提取条件进行优化。

1.3.4 DPPH抗氧化实验

精确称取DPPH粉末0.004 0 g，定容至100 mL棕色容量瓶中，避光保存。取2.00 mL不同质量浓度的正红菇多酚提取液，加入3.00 mL DPPH溶液，摇匀，置于暗处30 min，于517 nm的波长处测定该溶液的吸光度A1；将DPPH溶液用无水乙醇替代，同法操作，吸光度为A2；步骤同A1，将多酚提取液用无水乙醇替代，测吸光度A0，平行测定3次取平均值，按公式(2)进行DPPH自由基清除率的计算[10]。

(2)

2 结果与讨论

2.1 没食子酸标准曲线测定结果

图1 没食子酸标准曲线

以吸光度为纵坐标(y)，没食子酸浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，求得线性回归方程为：y=77.513x+0.009 3，R2=0.999 1。可以看出，在没食子酸浓度为0～0.006 4 mg/mL范围内，此标准曲线相关度高，可以用于多酚含量的计算。

2.2 单因素实验测定结果

2.2.1 液料比对正红菇多酚提取量的影响

如图2所示，正红菇多酚提取量随着液料比的增大先升高后基本保持不变，在液料比35∶1时，多酚提取量最高。原因可能是由于正红菇粉末与无水乙醇的接触面积随着液料比的升高而增大，使多酚物质的浸出效率提高，当液料比达到35∶1时，多酚基本完全浸出；但再加入溶剂会使某些难溶的物质被提取出来，对多酚的提取造成干扰[11]，同时溶剂用量过多也会造成资源的浪费。因此，选择液料比35∶1较为合适。

图2 液料比对正红菇多酚提取量的影响

2.2.2 乙醇体积分数对正红菇多酚提取量的影响

如图3所示，正红菇多酚提取量随着乙醇体积分数的增大先升高后降低，当乙醇体积分数达到60%时，多酚提取量最高。这可能与正红菇多酚的亲疏水性有关，多酚是一类极性范围很广的化合物[12]，乙醇与多酚的极性越接近，多酚提取量越大，乙醇与多酚的极性差距越悬殊，越不利于多酚物质的浸出[13]，60%的乙醇浓度可能与正红菇多酚的极性较为接近。因此，选择乙醇体积分数60%较为合适。

图3 乙醇体积分数对正红菇多酚提取量的影响

2.2.3 超声时间对正红菇多酚提取量的影响

如图4所示，正红菇多酚提取量随着超声时间的增加先升高后降低，在超声时间达到60 min时，多酚提取量最高。原因可能是随着超声时间的增加，细胞破壁率提高、物质传递速率增大，使多酚物质的浸出效率提高，在60 min时，多酚基本完全浸出；再提高超声时间，空气中的氧气会将提取出的多酚物质氧化[14]，使多酚提取量降低。因此，选择超声时间60 min较为合适。

图4 超声时间对正红菇多酚提取量的影响

2.2.4 超声温度对正红菇多酚提取量的影响

如图5所示，正红菇多酚提取量随着超声温度的增加先升高后降低，当超声温度达到50 ℃时，多酚提取量最高。原因可能是温度升高一定程度上有利于物质的传递，但温度过高，会导致多酚的结构被破坏甚至降解[15]。因此，选择超声温度50 ℃较为合适。

图5 超声温度对正红菇多酚提取量的影响

2.3 响应面实验结果分析

2.3.1 响应面实验设计

利用Box-Behnken进行响应面实验设计，实验因素水平见表1，响应面实验设计及结果见表2。

表1 因素水平

表2 响应面实验设计及结果

采用响应面软件对表2实验数据进行拟合分析，所得模型方程为：正红菇多酚提取量=3.53+0.079A-0.013B+0.037C+0.046D+4.175E-003AB+0.046AC-0.020AD-0.027BC-0.048BD+0.014CD-0.33A2-0.18B2-0.12C2-0.24D2

2.3.2 响应面方差分析

表3 回归模型方程的方差分析

2.3.3 各因素交互作用

响应面坡面的倾斜程度越大，提取量受该因素交互作用的影响就越强；反之越平缓，影响就越弱[16]。等高线呈圆形，说明各因素的交互作用较弱；呈椭圆形或马鞍形，说明交互作用较强[15-16]。各因素中，B与D的交互作用对多酚提取量的影响最强，如图6所示。但BD的P=0.097 8>0.05，说明其交互作用对多酚提取量的影响不显著，与2.3.2的结论相一致。同时，响应面开口朝下，说明正红菇多酚提取量随着各因素的增大先升高后降低，并具有最大值[9]，与2.2的分析相一致。

图6 乙醇体积分数和超声温度的交互作用对正红菇多酚提取量的影响

2.3.4 最佳提取工艺的确定及验证

通过单因素和响应面实验可知，正红菇多酚的最佳提取工艺为：液料比35.64∶1、乙醇体积分数59.36%、超声时间61.89 min、超声温度51.03 ℃，此时正红菇多酚提取量为3.536 7 mg/g。按实际实验条件修正为：液料比36∶1、乙醇体积分数59%、超声时间62 min、超声温度51 ℃，以修正后的条件进行3组平行实验，得到正红菇多酚提取量为3.575 0 mg/g，与理论值接近，表明该模型拟合良好，该工艺切实可行，具有实际应用价值。

2.4 DPPH抗氧化活性分析

如图7所示，正红菇中多酚提取物清除DPPH自由基的能力随质量浓度的升高而逐渐增大，当其浓度超过0.800 0 μg/mL时，清除效果趋于平缓。经线性拟合，正红菇多酚对DPPH自由基的IC50值为0.243 8 μg/mL，说明正红菇中多酚具有较好的抗氧化活性。

图7 正红菇多酚提取物对DPPH自由基的清除能力

3 结 论

本实验采用超声波辅助法从正红菇中提取多酚类物质，并通过单因素和响应面实验确定正红菇多酚最佳提取工艺为：液料比36∶1、乙醇体积分数59%、超声时间62 min、超声温度51 ℃，此时正红菇多酚提取量为3.575 0 mg/g。根据响应面分析结果，各因素对正红菇多酚提取量的影响依次为：液料比>超声温度>超声时间>乙醇体积分数。在DPPH自由基抗氧化活性实验中，正红菇多酚对DPPH自由基具有较强的清除能力，其IC50值为0.243 8 μg/mL，表明正红菇多酚具有较好的抗氧化能力，为正红菇的开发利用提供理论参考。