无毛蛋白在乳腺癌变和进展过程中的表达及临床意义

黄泽翎, 丁盼, 万立会, 刘浩, 赵雪可, 曹鸽, 周旭阳, 曹玉文, 3b

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤, 占女性癌症死亡原因第二位[1］, 越来越多的证据表明, 遗传因素和环境因素均可能与乳腺癌的发生和发展有关[2］, 寻找相对特异性分子标志物对于乳腺肿瘤的诊治和预后具有重要意义。Hr蛋白（hairless protein）即无毛蛋白[3］, 人Hr蛋白表达模式与小鼠一致, 在脑和皮肤高表达[3-4］。另有文献报道Hr基因突变与皮肤肿瘤的发生和存活密切相关[5］, Hr基因低表达导致胶质母细胞瘤病人的生存时间减少[6］, 因此, 探讨Hr蛋白对乳腺癌变及转移和预后的影响可能具有一定的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2007年1月至2015年12月石河子大学医学院第一附属医院石蜡包埋乳腺癌旁正常组织81例（距癌组织＞5 cm）、普通型导管增生79例、不典型导管增生26例、导管原位癌64例、浸润性导管癌138例。纳入标准：病理证实为原发性乳腺癌；术前未进行放化疗或内分泌治疗；有完整的临床病历资料。排除标准：合并有严重并发症和其他部位恶性肿瘤。临床分期采用第八版美国癌症联合委员会分期[7］, 组织学类型和分级基于2019年世界卫生组织乳腺肿瘤分类分级。雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）核染色≥1%为阳性。人表皮生长因子受体-2（HER-2）膜免疫染色3+或基于荧光原位杂交技术（FISH）基因扩增≥2.2倍为阳性。所有纳入病人签署知情同意书, 本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 免疫组织化学染色石蜡切片依次二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、高压微波抗原修复和3%双氧水封闭。滴加Hr抗体（1∶50；Santa Cruz, USA）于4 ℃孵育过夜, 滴加二抗（Dako Cytomation EnVision System, Dako, Denmark）孵育30 min, DAB溶液显色3-5 min, 苏木精复染5 min。切片由2名资深临床病理学家采用双盲法判读结果。细胞质出现黄色颗粒视为染色阳性。阳性细胞百分比的评分为0～4分（0分：0%～5%, 1分：＞5%～25%, 2分：＞25%～50%, 3分：＞50%～75%和4分：＞75%～100%）, 染色强度的评分为1～3分（0分：无着色, 1分：淡黄色, 2分：黄色和3分：棕黄色）。最后将阳性细胞百分比和染色强度评分相乘为总免疫组织化学分数, 0～4分为低表达, 5～12分为高表达。

1.3 随访所有浸润性导管癌病人均以电话或者门诊形式进行随访, 随访截止日期为2020年12月, 随访时间为5～148个月, 中位随访时间为76.5个月, 中位无复发生存时间为62.5个月, 中位总体生存时间为68.5个月。总生存时间（OS）定义为手术至病人死亡或随访截止时间, 无复发生存时间（RFS）定义为手术至乳腺局部复发时间, 转移定义为远处转移。到随访日期结束, 共计失访10例, 死亡46例, 存活82例；复发40例, 无复发88例；随访期间, 40例发生骨转移, 17例发生肝转移和16例发生肺转移。

1.4 数据库分析应用GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析Hr基因mRNA在乳腺癌组织中的 表 达[8］, 设 定 条 件：（1） gene： Hr, （2） cancer： Breast invasive carcinoma。HCMDB数据库（http：//hcmdb.i-sanger.com/index）分析Hr mRNA在乳腺癌器官转移组织中的表达[9］, 设定条件：（1） gene： Hr, （2）cancer： Breast invasive carcinoma。UALCAN在线工具（http：//ualcan.path.uab.edu/）分析Hr mRNA与乳腺癌病人临床病理参数的相关性[10］, 筛选条件：（1）gene：Hr, （2）TCGA dataset： Breast invasive carcinoma。Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/）分析Hr mRNA表达与乳腺癌预后的关系[11］, 设置条件：（1）cancer： Breast cancer；（2）gene： Hr；（3）survival：Overall survival（OS） / Rescurrencefree survival（RFS）。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 统计学方法应用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8软件进行数据的录入与分析。使用±s描述符合正态分布的计量资料, 多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的计量资料以中位数（第25、第75百分位数）[M（P25,P75）］表示, 采用非参数秩和检验进行组间的比较。计数资料以例（%）表示, 采用χ2检验。应用Spearman等级相关分析检验Hr蛋白在器官转移中的相关性。使用Kaplan-Meier分析和log-rank检验分析乳腺癌生存资料。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hr蛋白在乳腺癌变过程组织中表达免疫组织化学染色结果显示, 乳腺上皮细胞质出现黄色颗粒为Hr蛋白表达, Hr在乳腺癌旁正常组织、普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌中的免疫组织化学评分逐渐减少（P＜0.001）, 五组间两两比较, 正常组织（P＜0.001）、普通型增生（P＜0.001）、不典型增生（P=0.018）、原位癌（P=0.021）分别与浸润癌之间的表达差异有统计学意义, 普通型增生与原位癌之间差异有统计学意义（P=0.034）, 详见图1；表1, 2。GEPIA数据库结果显示, 与正常乳腺组织2.62（2.24, 3.00）相比, Hr mRNA水平在乳腺癌组织1.85（0.78, 2.92）中呈现低表达（Z=-5.83,P＜0.001）。

图1 正常乳腺组织到浸润性导管癌细胞HE染色图（×200）及相应无毛蛋白免疫组织化学染色图（×200）

表1 乳腺癌变过程组织中Hr蛋白表达强度/例（%）

表2 乳腺癌变过程组织中Hr蛋白表达评分比较

2.2 Hr蛋白表达与乳腺癌病人临床病理特征的相关性Hr蛋白高表达与淋巴结转移、TNM晚分期、PR阴性具有相关性（P＜0.05）, 见表3。UALCAN数据库揭示Hr基因mRNA高表达分别与淋巴结转移、TNM晚分期及ER、PR、HER-2表达阴性差异有统计学意义（P＜0.05）, 见图2。

表3 Hr蛋白表达与乳腺癌（浸润性导管癌）138例临床病理参数的相关性/例（%）

图2 Hr mRNA与临床病理参数关系：A为Hr与淋巴结转移；B为Hr与临床分期；C为Hr与雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体-2（HER-2）

2.3 Hr蛋白与乳腺癌骨转移风险分析上述研究显示Hr高表达与病人TNM晚分期有关, 进一步检测Hr与乳腺癌发生骨、肝脏和肺脏转移的相关性, 结果显示, Hr蛋白与乳腺癌骨转移具有明显正相关性（P=0.005）, 见表4, 图3。并且与未发生骨转移的乳腺癌组织2.50（0.00, 6.00）相比, Hr蛋白在发生骨转移的乳腺癌组织7.00（2.50, 8.00）中显著高表达（Z=-3.42,P=0.001）；HCMDB数据库也显示, 与未发生骨转移的乳腺癌组织2.75（1.80, 4.20）相比, Hr mRNA水平在发生骨转移乳腺癌组织4.48（2.48, 7.75）中呈现高表达（Z=-3.32,P=0.002）, 本研究与其一致, 提示Hr分子可能与促进乳腺癌发生骨转移相关。在此基础上, 进一步分析临床病理参数与乳腺癌发生骨转移的相关性, 结果显示组织学低分级、淋巴结转移和TNM晚分期与骨转移差异有统计学意义（P＜0.05）, 说明低分级、淋巴结转移和TNM晚分期是乳腺癌发生骨转移的危险因素, 见表5。

图3 无毛蛋白在无骨转移和骨转移乳腺癌中表达（免疫组织化学染色×200）：3A为无骨转移；3B为骨转移

表4 Hr蛋白与乳腺癌（浸润性导管癌）138例器官转移的相关性/例

表5 临床病理参数与乳腺癌（浸润性导管癌）138例骨转移的相关性/例

2.4 Hr蛋白对乳腺癌预后的影响前期研究发现, Hr分子与淋巴结转移、TNM晚分期以及骨转移具有相关性, 进一步探讨Hr蛋白对乳腺癌病人生存状态的影响, Kaplan-Meier 生存分析结果显示, Hr高表达病人的无复发生存率和总体生存率低于Hr低表达病人（P＜0.05）, Kaplan-Meier plotter数据库显示Hr mRNA高表达与无复发生存率和总体生存率降低显著相关（P＜0.05）, 提示Hr分子是乳腺癌预后不良的因素, 详见图4。

图4 无毛蛋白对乳腺癌（浸润性导管癌）138例预后的影响：4A为无毛蛋白与病人无复发生存曲线；4B为无毛蛋白与病人总体生存曲线；4C为无毛蛋白mRNA与病人无复发生存曲线；4D为无毛蛋白mRNA与病人总体生存曲线

3 讨论

本研究发现, Hr蛋白在乳腺正常组织、普通型导管增生、不典型导管增生、导管原位癌、浸润性导管癌中的表达水平逐渐降低, 提示Hr分子在乳腺连续癌变过程中可能扮演抑癌基因角色。目前研究较多的是Hr突变与肿瘤的关系, 在药物和紫外线诱导下的Hr突变无毛老鼠发生皮肤乳头状瘤比率显著高于有毛老鼠[12-14］, 随后Kim等[15］发现紫外线照射后的老鼠Hr阴性者更容易发生皮肤鳞状细胞癌, 有学者报道Hr突变与胶质母细胞瘤及其他脑肿瘤相关[6］, 并且其表达水平明显降低。与本实验结果相一致, 说明Hr低表达能促进肿瘤形成。通过组间比较发现, Hr在乳腺正常组织、普通型增生、不典型增生、原位癌中的表达分别显著高于浸润癌, 提示Hr蛋白低表达可能促进正常上皮发生良性增生甚至恶性转化, 在乳腺癌变阶段和早期浸润阶段发挥抑癌基因作用。

我们进一步分析Hr对乳腺癌病人临床病理特征的影响, 发现Hr高表达的病人更容易发生淋巴结转移、TNM晚期以及ER、PR、HER-2表达阴性, 提示Hr蛋白可能促进乳腺癌恶性进展和转移。因此, 有必要探讨Hr蛋白对乳腺癌远处转移的影响, 结果显示Hr在发生骨转移的乳腺癌组织中表达明显升高, 进而分析Hr与乳腺癌骨转移的关系, 结果显示Hr与乳腺癌骨转移明显相关而与肝和肺转移无显著性, 提示Hr蛋白在乳腺癌骨转移中可能作为癌基因角色发挥促进作用。有研究发现, 血清维生素含量低水平乳腺癌妇女的总体存活率和无病生存期较差[16］, 此外, 组织学低分级、淋巴结转移和TNM晚分期也是乳腺癌发生骨转移的重要因素。STRING数据库显示Hr与JMJD8蛋白相互作用, JMJD8激活AKT/GSK3β/β-catenin信号通路上调靶基因MMP9表达[17］, 从而增强骨质溶解促进肿瘤细胞骨转移的发生[18］, 提示Hr蛋白促进骨转移可能与上述分子及机制有关, 有待我们进一步分析探讨。最后本研究显示Hr蛋白高表达的乳腺癌病人预后更差, 有文献报道Hr低表达的胶质母细胞瘤病人预后较差[6］, 与我们研究结果不一致, 可能与Hr在不同的肿瘤中发挥不同的作用有关。

综上所述, Hr是影响乳腺癌病人的预后因素, 可能成为评估乳腺癌预后的指标。