尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化与血清高迁移率族蛋白B1、中性粒细胞胞外诱捕网的关系

胡海峰, 张弦, 王水俐

尿毒症是肾功能丧失后, 机体内部产生的一系列临床综合征[1］。血液透析是治疗慢性肾衰竭、尿毒症的常用手段, 然而长期血液透析会导致病人出现动脉粥样硬化等各种并发症[2-3］。因此, 如何有效预防尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化是临床医师关注的重难点。高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1, HMGB1）是一种具有免疫调节功能的细胞因子[4］。中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps, NETs）是中性粒细胞活化过程中释放的一种胞外网状结构[5］。目前关于HMGB1、NETs与尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化的关系有待进一步探究。因此, 本研究通过探讨HMGB1、NETs与225例尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化的相关性, 以期为临床防治动脉粥样硬化提供一定的实验室依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年1月至2020年1月上海杨思医院收治的225例尿毒症血液透析病人为研究对象。根据是否并发动脉粥样硬化将病人分为非动脉粥样硬化组119例、动脉粥样硬化组106例。其中非动脉粥样硬化组年龄（47.14±13.07）岁, 透析时间（52.94±12.83）月；动脉粥样硬化组年龄（67.24±13.64）岁, 透析时间（54.36±13.24）月。

纳入标准：①病人依据《慢性肾脏病及透析的临床实践指南》[6］诊断为慢性肾衰竭, 且血肌酐水平超过707 μmol/L, 符合尿毒症临床诊断标准, 血液透析≥6个月者, 动脉粥样硬化病人经血液检查、超声检查、X线等一系列检查确诊；②病人临床资料及影像学资料齐全, 研究经上海杨思医院伦理委员会审核通过（批号190002）, 病人均知情且同意参加；③入组前2周内未使用免疫抑制剂、抗炎、维生素、干扰素、血液制品等药物治疗者。

排除标准：①既往有先天性心血管疾病者；②有恶性肿瘤、自身免疫性疾病及肝脏疾病者；③妊娠或哺乳期妇女；④存在精神障碍疾病者。

1.2 主要试剂与仪器HMGB1 ELISA试剂盒（货号CK-E11683）购自武汉益普生物科技有限公司。全自动生化分析仪（型号Cobas 6000）购自瑞士罗氏公司；全波长酶标仪（型号Multiskan GO）购自北京赛百奥科技有限公司；荧光酶标仪（型号SpectraMax Gemini XPS）购自美国Molecular Devices公司；彩色多普勒超声诊断仪（型号Technos MPX DU6）购自意大利百胜公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存 采集尿毒症血液透析病人透析6个月后清晨空腹静脉血, 3 000 r/min离心15 min后收集血清, 置于-80 ℃保存待测。

1.3.2 一般资料收集 查阅门诊及住院病历, 收集病人一般资料, 主要包括年龄、性别、体质量指数（BMI）、透析时间、收缩压、舒张压及吸烟、高血压、糖尿病。

1.3.3 血清HMGB1水平及生化指标水平测定 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清HMGB1水平, 采用全自动生化分析仪检测钙、磷、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平, 操作严格按照试剂盒及仪器说明书进行, 并计算钙磷乘积。

1.3.4 血清NETs水平测定 采用荧光染色法检测血清NETs水平。根据标准品溶液的荧光值作直线回归方程制备标准曲线；血清中加入PicoGreen染料后避光孵育10～20 min, 采用荧光酶标仪检测样品荧光值；根据标准曲线计算样品NETs水平。

1.3.5 内膜中层厚度（intima-media thickness, IMT）检测 采用彩色多普勒超声诊断仪检测病人IMT值, 探头10 MHz。受检者取仰卧位, 从颈根部向上连续观察双侧颈总动脉, 测量长轴后壁内膜到中膜之间的垂直距离, 即为颈总动脉IMT, 测量3次取平均值为IMT值。

1.4 统计学方法利用SPSS 23.0软件进行分析。计量资料经检验符合正态分布, 以±s表示, 两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例（%）表示, 组间比较行χ2检验；采用Pearson法分析尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化病人血清HMGB1、NETs与IMT及生化指标的相关性；采用多因素logistic回归分析影响尿毒症血液透析病人动脉粥样硬化发生的因素, 采用向前法筛选自变量, 入选α=0.05, 剔除α=0.10。P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非动脉粥样硬化组、动脉粥样硬化组一般资料比较非动脉粥样硬化组、动脉粥样硬化组性别、BMI、透析时间、收缩压、舒张压及吸烟、高血压、糖尿病病人比例比较, 差异无统计学意义（P＞0.05）；动脉粥样硬化组年龄高于非动脉粥样硬化组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组尿毒症血液透析病人一般资料比较

2.2 非动脉粥样硬化组、动脉粥样硬化组生化指标水平比较非动脉粥样硬化组、动脉粥样硬化组钙、磷、钙磷乘积比较, 差异无统计学意义（P＞0.05）；动脉粥样硬化组三酰甘油、总胆固醇、LDL-C水平高于非动脉粥样硬化组, HDL-C水平低于非动脉粥样硬化组, 差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组尿毒症血液透析病人血液生化指标水平比较/±s

表2 两组尿毒症血液透析病人血液生化指标水平比较/±s

注：LDL-C为低密度脂蛋白胆固醇, HDL-C为高密度脂蛋白胆固醇。

组别非动脉粥样硬化组动脉粥样硬化组t值P值例数119 106钙/（mol/L）2.06±0.32 2.05±0.31 0.24 0.813磷/（mol/L）1.42±0.58 1.35±0.54 0.93 0.352钙磷乘积34.86±13.92 33.42±13.75 0.78 0.437三酰甘油/（mmol/L）2.02±0.42 2.53±0.51 8.22＜0.001总胆固醇/（mmol/L）4.20±1.16 5.48±1.21 8.10＜0.001 LDL-C/（mmol/L）2.42±0.61 3.20±0.64 9.36＜0.001 HDL-C/（mmol/L）1.24±0.11 1.10±0.12 9.13＜0.001

2.3 非动脉粥样硬化组、动脉粥样硬化组血清HMGB1、NETs水平及IMT比较动脉粥样硬化组血清HMGB1、NETs水平及IMT高于非动脉粥样硬化组（P＜0.05）, 详情见表3。

表3 两组尿毒症血液透析病人血清HMGB1、NETs水平及IMT比较/±s

表3 两组尿毒症血液透析病人血清HMGB1、NETs水平及IMT比较/±s

注：HMGB1为高迁移率族蛋白B1, NETs为中性粒细胞胞外诱捕网, IMT为内膜中层厚度。

组别非动脉粥样硬化组动脉粥样硬化组t值P值例数119 106 HMGB1/（μg/L）6.21±1.16 8.94±2.33 11.31＜0.001 NETs/（μg/L）194.58±20.23 416.82±45.61 48.12＜0.001 IMT/mm 0.89±0.19 1.10±0.24 7.31＜0.001

2.4 尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化病人血清HMGB1、NETs与IMT及生化指标的相关性Pearson法分析结果显示, 尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化病人血清HMGB1与NETs 呈正相关（r=0.54,P＜0.001）。此外, 尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化病人血清HMGB1、NETs与IMT、三酰甘油、总胆固醇、LDL-C呈正相关, 与HDL-C呈负相关（P＜0.001）, 见表4。

表4 尿毒症血液透析合并动脉粥样硬化106例血清HMGB1、NETs与生化指标的Pearson相关性分析

2.5 影响尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化的多因素logistic回归分析将尿毒症血液透析病人是否发生动脉粥样硬化作为因变量, 矫正IMT、三酰甘油、总胆固醇、LDL-C、HDL-C、年龄等混杂因素后, 以HMGB1、NETs为自变量（按两组总均值转化成两分类变量）进行多因素logistic回归分析（逐步向前法）, 结果显示HMGB1、NETs均是影响尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化的独立危险因素（P＜0.05）。见表5。

表5 影响尿毒症血液透析病人225例动脉粥样硬化发生的多因素logistic回归分析

3 讨论

动脉粥样硬化是血液透析病人常见并发症, 病人确诊已较为严重[7-8］。研究表明, 颈动脉粥样硬化与脑动脉、冠状动脉粥样硬化均有密切关系, 可预测心脑血管疾病发生的危险性及严重程度, 颈动脉粥样硬化同时也是尿毒症病人致残、致死主要原因之一[9-10］。动脉粥样硬化可能与高同型半胱氨酸血症、脂代谢异常、慢性炎症等有关[11-12］。临床早期诊断、早期预防动脉粥样硬化, 对降低尿毒症血液透析病人心血管事件发生率可能有重要意义。

NETs主要有促凝、抗炎、促炎等生物学作用, 其自身独特的网状结构既可以发挥抑制炎症反应的作用, 同时也具有促炎的效果[13-14］。研究表明, NETs中自体DNA复合物及中性粒细胞产生的抗菌肽等颗粒蛋白能刺激血管壁中血浆树突细胞活化, 自体免疫被激活, 进而导致动脉粥样硬化的形成[15］。本研究结果显示, 尿毒症血液透析并发动脉粥样硬化病人血清NETs呈高表达, 与刘娜娜、姜文[16］研究基本一致。提示NETs的高表达可能与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。基于既往研究及NETs的作用机制推测其可能机制是NETs被激活后, 产生的游离DNA形成复合物, 进一步刺激血管壁中血浆树突细胞活化, 自体免疫及内皮细胞损伤等协同作用, 进而导致动脉粥样硬化形成。HMGB1是普遍存在于真核生物细胞核内的染色体结合蛋白, 其在病理状态下可从活化细胞或受损细胞核内被释放到胞外[17］。Ding等[18］研究表明, HMGB1通过与炎性因子相互作用, 共同促进动脉粥样硬化的病理过程。本研究结果中HMGB1在尿毒症血液透析并发动脉粥样硬化病人血清中高表达, 且与NETs呈正相关, 二者均是影响尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化的因素。Wang等[19］研究结果中NETs可通过调控HMGB1相关通路触发中性粒细胞募集。Zha等[20］研究结果中NETs可通过调控HMGB1相关通路参与肿瘤微环境及胶质瘤的进展。基于既往研究结果, 推测本研究中NETs除了直接激活自体免疫介导动脉粥样硬化的发生外, 还可能通过调控HMGB1的表达, 激活HMGB1相关通路, 介导炎症反应, 进而参与动脉粥样硬化的发生发展。但其具体生物机制需进一步通过细胞或动物试验验证。此外, 本研究中血清HMGB1、NETs与IMT及三酰甘油、总胆固醇、LDL-C、HDL-C等血脂指标均呈明显的相关性。高俊杰[21］研究表明, 血脂异常、血管IMT增厚是早期动脉粥样硬化的表现。因此, 本研究进一步推测血清HMGB1、NETs在尿毒症血液透析病人动脉粥样硬化的发生中发挥重要作用, 二者水平变化对动脉粥样硬化的发生有重要提示作用, 警示临床应及早介入治疗, 减少动脉粥样硬化的发生。

综上所述, HMGB1、NETs在尿毒症血液透析并发动脉粥样硬化病人血清中表达水平升高, 且与IMT、血脂指标呈明显相关性。提示HMGB1、NETs可能与尿毒症血液透析病人动脉粥样硬化的发生、发展密切相关, 需引起临床医师的重视。目前临床中仅显示HMGB1、NETs可能参与动脉粥样硬化疾病的发展, 而本研究进一步明确了二者在尿毒症血液透析病人中的表达情况及其与透析病人动脉粥样硬化发展的关系, 为临床预防血液透析病人动脉粥样硬化疾病的发生提供新思路。但因本研究收集病人数量有限, 病人间可能存在个体性差异, HMGB1、NETs在临床指导治疗中的具体作用仍需进一步验证。且HMGB1、NETs影响尿毒症血液透析病人并发动脉粥样硬化的机理尚需进一步探究。