SFRP5调控Wnt/β-Catenin信号通路对子痫前期滋养细胞迁移和侵袭的作用机制研究*

李 娜,彭 娜,姚 霞,朱 燕,贾建桃

1.长治医学院附属和济医院产科，山西长治 046000；2.长治医学院基础医学部，山西长治 046000

子痫前期(PE)是临床常见的妊娠期特异性并发症，好发于妊娠20周以后，是导致孕妇死亡的重要原因[1]。PE的主要症状为高血压和尿蛋白升高，如未得到及时有效治疗，可引起胎盘早剥、胎儿生长受限、围产期死亡等多种不良妊娠结局。同时，显著增加胎儿未来罹患心血管疾病的风险[2]。目前普遍认为，绒毛膜滋养细胞迁移和侵袭减少引起的胎盘功能障碍是PE的核心病理基础，但其调控机制尚未阐明[3]。研究表明，PE发病机制受到多种信号通路的调控，如Notch、MAPK、Wnt和NF-κB等[4-6]。其中，经典的Wnt/β-catenin信号通路在调节胚胎黏附、着床、滋养层细胞融合、增殖、侵袭和分化等方面发挥重要作用[7]。因此，探索PE过程中调控Wnt/β-catenin信号通路的病理因素具有重要意义。分泌卷曲相关蛋白5(SFRP5)作为分泌型糖蛋白家族成员之一，结构上与Wnt信号特异性卷曲蛋白(Fz)受体极为相似，可竞争性抑制Wnt蛋白活性[8]。有研究显示，SFRP5可通过作用于Wnt信号通路抑制肿瘤细胞的生长、侵袭、迁移和肿瘤形成，发挥抑癌作用[9-10]。但SFRP5与PE的关系及对滋养细胞的影响目前鲜少研究。本研究旨在评估SFRP5在PE患者胎盘和血清中的水平，并探讨其对人类滋养细胞迁移和侵袭的影响，揭示PE的潜在分子机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月至2021年10月在长治医学院附属和济医院(简称本院)产科收治的15例PE患者(PE组)和15例健康孕妇(正常组)及作为研究对象，收集研究对象剖宫产手术中获得的胎盘组织和血液样本。纳入标准：(1)PE患者符合人民卫生出版社(第9版)《妇产科学》中的相关诊断标准；(2)年龄18～40岁，孕周34～40周，孕前体重指数(BMI)为18.5～24.9 kg/m2；(3)75 g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)阴性；(5)单胎妊娠；(6)剖宫产分娩。排除标准：(1)孕前合并高血压、内分泌和免疫系统疾病、恶性肿瘤及传染病；(2)有不良孕产史；(3)有其他妊娠合并症及并发症。另选取在本院同期妊娠7～10周无任何并发症的人工流产孕妇5例作阴性对照，纳入研究的患者均签署知情同意书，且本研究通过本院伦理委员会审核(GS20190622)。

1.2仪器与试剂 RPMI 1649培养基购自美国Gibco公司，货号21870084；胎牛血清购自美国Gibco公司，货号10099141；免疫组化染色试剂盒购自上海碧云天公司，货号SP-9000；氯化锂(LiCl)购自美国Sigma公司，货号L9650；重组Dickkopf相关蛋白1(Dkk-1)购自美国Sigma公司，货号SRP3258；CCK8试剂盒购自北京索莱宝公司，货号CA1210；重组人SFRP5蛋白购自美国Abcam公司，货号ab202176；SFRP5 ELISA试剂盒购自武汉USCN公司，货号E-EL-H5544c；多重基质金属蛋白酶(MMP)酶谱检测试剂盒购自北京普利莱公司，货号P1700；糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抗体购自美国Cell signaling technology公司，货号9327S；SFRP5抗体购自美国Abcam公司，货号ab230425；β-catenin购自美国Santa Cruz公司，货号sc-7963；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，货号sc-81178。细胞培养箱购自美国NUAIRE公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；FC型酶标仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.3方法

1.3.1组织样本采集 剖宫产手术前收集PE组和正常组空腹静脉血5 mL，离心提取血清，-80 ℃保存备用。阴性对照孕妇术中胎盘娩出后0.5 h内，从母体面剥离未见明显梗死、钙化、血肿或撕裂、位于脐带插入点和胎盘外周边缘之间约1 cm3的胎盘组织，保存在-80 ℃冰箱中，用于后续蛋白免疫印迹实验研究。另取PE组部分新鲜足月胎盘组织用4%多聚甲醛固定用于免疫组化染色，以及收集阴性对照孕妇的妊娠初期蜕膜和胎盘绒毛组织。

1.3.2免疫组化染色检测胎盘组织SFRP5表达 取经4%多聚甲醛固定后的胎盘组织，常规石蜡包埋、切片(4 μm)、脱蜡、水化后，3%双氧水甲醇溶液中孵育10 min以淬灭内源性过氧化物酶活性，0.01 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中煮沸20 min以恢复抗原。室温下山羊血清封闭15 min，加入SFRP5抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜。次日，磷酸盐缓冲液充分洗涤后，加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育1 h。最后加入二氨基联苯胺显色，苏木精反染，封片，显微镜拍照记录，阳性表达为棕黄色。以正常组健康人体皮肤组织作为阳性对照，阴性对照孕妇的妊娠初期蜕膜、胎盘绒毛组织、正常组足月胎盘组织为正常对照，正常对照、阳性对照石蜡切片由本院病理科提供。

1.3.3酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测血清SFRP5表达 采集PE组和正常组的空腹血样，4 ℃静置4 h，4 ℃ 3 500 r/min离心10 min离心，取上清液，使用SFRP5 ELISA试剂盒检测血清中SFRP5水平。

1.3.4滋养细胞培养和分组 人绒毛膜滋养层细胞HTR8/SVneo(简称HTR8/SVneo滋养细胞)购自ATCC中国细胞库。常规复苏后，置于含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1649培养基中，放置在含有5% CO2的37 ℃全湿度细胞培养箱中培养。当细胞融合率达到80%～90%时传代处理。HTR8/SVneo滋养细胞随机分为6组：对照组、SFRP5组、LiCl组、SFRP5+LiCl组、Dkk-1组和Dkk-1+LiCl组。

胰酶消化细胞重新悬浮并接种于6孔板。细胞聚集达60%～70%后，更换为无血清培养基。根据已报道文献[11]实验剂量，6组HTR8/SVneo滋养细胞按照重组人SFRP5蛋白(100 ng/mL)、LiCl(1 mmol/L)和重组人Dkk-1蛋白(50 ng/mL)的剂量处理24 h后做后续HTR8/SVneo滋养细胞迁移和侵袭检测实验研究，对照组HTR8/SVneo滋养细胞不作任何处理。

1.3.5CCK-8法检测HTR8/SVneo滋养细胞活力 将HTR8/SVneo滋养细胞(5×103个/mL)接种于96孔板中培养12 h。细胞贴壁后更换无血清培养基，放入37 ℃的5% CO2细胞培养箱中继续培养。根据文献[12-13]报道药物处理浓度，用含有不同浓度LiCl(10、20、50、100、200和500 μmmol/L，1、2、5、10、20、30、40和50 mmol/L)和Dkk-1(1、2、5、10、20、50、60、80和100 ng/mL)的新鲜培养基替换原培养基。培养12 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂继续培养1 h。根据每孔细胞在450 nm波长下的吸光度(A值)计算细胞活力。

1.3.6划痕实验检测HTR8/SVneo滋养细胞迁移 将HTR8/SVneo滋养细胞接种于6孔板中，并接受1.3.3描述方法处理。细胞量达到90%后，用10 μL无菌枪头对细胞单层沿直线做轻轻划痕，培养24 h。在0、6、12和24 h，用光学显微镜40倍放大拍照记录图像。使用Image J评估划痕愈合面积，并计算迁移面积：迁移面积=0 h划痕愈合面积-24 h划痕愈合面积。

1.3.7基底胶Transwell侵袭实验检测HTR8/SVneo滋养细胞侵袭能力 以基底胶(1∶9稀释)预涂于 Transwell小室。将HTR8/SVneo滋养细胞以1.0×105个/小室接种于上述Transwell小室，并在下室加入600 μL含有10% FBS的培养基。培养24 h后，甲醇固定，结晶紫染色，清洗，拍照。显微镜下随机选取5个视野进行记数求平均值。

1.3.8明胶酶谱实验检测HTR8/SVneo滋养细胞MMP活性 收集6组HTR8/SVneo滋养细胞培养液上清液。将明胶加入0.1% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺分离胶中，加入6组HTR8/SVneo滋养细胞培养液上清液后进行电泳。用50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 7.5)、5 mmol/L CaCl2和2.5%聚乙二醇辛基苯基醚清洗凝胶，37 ℃下孵育过夜。考马斯亮蓝染色，洗脱，保存，并干燥。采用凝胶成像系统扫描拍照，以Image J软件分析图像，以6组HTR8/SVneo滋养细胞MMP条带与空白对照条带恢复值之比表示MMP活性。

1.3.9蛋白免疫印迹法检测各组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β、β-catenin、SFRP5蛋白表达水平 用RIPA裂解缓冲液将经过各种处理的HTR8/SVneo滋养细胞提取总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。6组HTR8/SVneo滋养细胞按25 μg蛋白上样量经10% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，200 mA恒流转膜到聚偏氟乙烯膜。5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗膜后，加入GSK3β、β-catenin、SFRP5和β-actin的特异性抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 500稀释)孵育1 h。使用增强化学发光法检测，拍照，以β-actin为内参，使用Image J软件进行灰度值分析。

2 结 果

2.1两组一般情况比较 与正常组相比，PE组年龄、孕初BMI和孕期增重比较差异均无统计学意义(P>0.05)。PE组平均收缩压(SBP)和舒张压(DBP)比正常组升高，而新生儿出生体重和胎盘重量比正常组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 PE组与正常组一般情况比较

2.2正常组和PE组胎盘组织和血清中SFRP5的表达比较 免疫组化法检测结果显示，与阳性对照比较，正常组和PE组中均为SFRP5阴性表达。见图1。ELISA结果显示，与正常组[(9.03±1.75)ng/mL)]相比，PE组血清SFRP5水平[(48.07±3.81)ng/mL]显著升高，差异有统计学意义(t=36.063、P<0.001)。

注：A～J免疫组化染色，A、B、C、G和H依次为D、E、F、I和J所示黑色虚线框内区域的放大图像；A/D为阳性对照，箭头表示SFPR5阳性角质细胞；E、F、I/B、C、G为正常对照，E/B为阴性对照孕妇的妊娠初期蜕膜组织、F/C为阴性对照孕妇的妊娠初期胎盘绒毛组织、I/G为正常组足月胎盘组织；J/H为PE组足月胎盘组织。

2.3Dkk-1和LiCl刺激对HTR8/SVneo滋养细胞活力的影响 CCK8法检测结果显示，不同浓度Dkk-1和LiCl刺激对HTR8/SVneo滋养细胞活力产生不同的影响，无明显梯度规律，见图2。与对照组比较，1 mmol/L LiCl和50 ng/mLDkk-1对HTR8/SVneo滋养细胞活力的抑制作用最小，差异有统计学意义(t=4.953、3.162,P<0.05)。

注：a表示CCK8法检测梯度浓度LiCl对HTR8/SVneo滋养细胞的活性影响；b表示CCK8法检测梯度浓度Dkk-1对HTR8/SVneo滋养细胞的活性影响；蓝柱表示LiCl和Dkk-1的最适浓度；与对照组比较，*P<0.05。

2.4SFRP5对HTR8/SVneo滋养细胞迁移的影响 划痕实验结果显示，SFRP5+LiCl组、SFRP5组、LiCl组、对照组、Dkk-1组和Dkk-1+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞24 h划痕愈合百分比分别为(14.6±1.2)%、(5.4±0.2)%、(52.4±0.9)%、(34.2±0.8)%、(1.8±0.3)%和(22.1±0.6)%。可见，SFRP5组HTR8/SVneo滋养细胞24 h划痕愈合百分比显著小于对照组，差异有统计学意义(t=11.762、P<0.001)。与对照组相比，LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞24 h划痕愈合百分比显著增加(t=4.389、P=0.007)；与LiCl组相比，SFRP5组和SFRP5+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞24 h划痕愈合百分比明显降低(t=8.082、P<0.001；t=4.93、P=0.004)；与LiCl组相比，SFRP5+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞24 h划痕愈合百分比亦显著降低(t=12.471、P<0.001)。此外，Dkk-1组和Dkk-1+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞的24 h划痕愈合百分比均显著低于对照组(t=8.655、P<0.001；t=1.681、P=0.154)；与LiCl组相比，Dkk-1+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞24 h划痕愈合百分比亦显著降低(t=12.023、P<0.001)，见图3。

图3 6组HTR8/SVneo滋养细胞迁移能力比较(×40)

2.5SFRP5对HTR8/SVneo滋养细胞侵袭能力的影响 基底胶Transwell侵袭实验结果显示，SFRP5+LiCl组、SFRP5组、LiCl组、对照组、Dkk-1组和Dkk-1+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞侵袭细胞数分别为(129.78±2.91)个、(84.67±3.34)个、(487.98±5.43)个、(159.89±2.69)个、(41.67±2.96)个和(81.32±3.67)个。与对照组相比，SFRP5组HTR8/SVneo滋养细胞侵袭细胞数量明显降低(t=14.434、P<0.001)；LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞侵袭细胞数量显著增多(t=3.712、P=0.014)。与LiCl组相比，SFRP5组和SFRP5+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞侵袭细胞数量均明显减少(t=7.670、P<0.001；t=6.757、P<0.001)；与LiCl组相比，SFRP5+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞侵袭细胞数量亦显著降低(t=6.166、P<0.001)。与对照组相比，Dkk-1组和Dkk-1+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞侵袭细胞数量均显著降低(t=33.541、P<0.001；t=8.385、P<0.001)；与LiCl组相比，Dkk-1+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞侵袭细胞数量亦显著降低(t=8.305、P<0.001)，见图4。

图4 SFRP5处理后HTR8/SVneo滋养细胞侵袭比较(×200)

2.6SFRP5对各组HTR8/SVneo滋养细胞MMP-2/9活性的影响 明胶酶谱法检测HTR8/SVneo滋养细胞中MMP-2/9活性，结果显示，与对照组HTR8/SVneo滋养细胞MMP-2/9活性[依次为(1.02±0.04)和(1.06±0.03)]相比，SFRP5组HTR8/SVneo滋养细胞MMP-2(0.58±0.09)和MMP-9(0.52±0.23)活性均显著降低，差异有统计学意义(t=4.193、P=0.016；t=2.887、P=0.034)。见图5。

图5 SFRP5处理后HTR8/SVneo滋养细胞中MMP-2/9活性

2.7SFRP5对HTR8/SVneo滋养细胞中Wnt/β-Catenin信号通路表达的影响 蛋白免疫印迹结果表明，对照组HTR8/SVneo滋养细胞SFRP5蛋白阴性表达，这与胎盘免疫组化的结果一致；与对照组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达、β-catenin表达[依次为(1.05±0.03和1.02±0.02)]比较，SFRP5组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达(1.72±0.87)增加，β-catenin表达(0.21±0.04)减少，差异有统计学意义(t=10.392、P<0.01,t=12.124、P<0.001)；与对照组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达、β-catenin表达比较，LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达(0.24±0.05)降低，β-catenin表达(1.33±0.13)增加(t=5.196、P=0.003，t=7.031、P<0.001)；与对照组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达、β-catenin表达比较，Dkk-1组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达(2.26±0.46)增加，β-catenin表达(0.16±0.05)降低(t=8.660、P<0.001，t=15.155、P<0.001)。与LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞β-catenin表达、GSK3β表达[依次为(1.33±0.13和0.24±0.05)]相比，SFRP5+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞β-catenin表达(0.54±0.09)降低(t=6.433、P<0.001)，而GSK3β表达(0.31±0.06)比较差异无统计学意义(t=2.004、P=0.076)；与LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达、β-catenin表达相比，Dkk-1+LiCl组HTR8/SVneo滋养细胞GSK3β表达(8.23±1.43)增加，而β-catenin表达(0.33±0.06) 降低(t=16.267、P<0.001，t=6.193、P<0.001)。见图6。

图6 SFRP5处理促进HTR8/SVneo滋养细胞中SFRP5、GSK3β和β-catenin蛋白的表达

3 讨 论

PE是造成当今世界围产期病死率的主要原因之一，每年约导致6万名产妇死亡[2]。然而，目前临床缺乏有效的预防和治疗方法，这与PE的具体病因尚未完全阐明有关。研究发现，Wnt/β-catenin信号通路作为可调控细胞增殖、迁移、侵袭和死亡等生物学过程的重要信号转导通路，其活性异常参与多种产科、妇科和代谢性疾病[14]。最近的研究表明，重度PE胎盘中Wnt、β-catenin、c-myc和cyclinD1表达水平较对照组显著降低[15-16]。提示Wnt/β-catenin信号通路异常可能参与调控PE的发生发展。SFRP5是分泌卷曲相关蛋白家族的成员，由于其在结构上与Wnt信号通路中的Fz受体非常相似，故通常作为Wnt信号通路抑制剂而被人们所熟知[8]，但SFRP5与PE的关系及对滋养细胞的作用尚不明确。

本研究结果发现，与正常组比较，PE组血清SFRP5水平明显升高。而正常对照及PE组胎盘组织中SFRP5阴性表达，这提示血清SFRP5的异常升高可能参与了PE的发展。研究发现，SFRP5启动子可发生高甲基化，在一些肿瘤组织中SFRP5的表达减少[9-10]。推测启动子甲基化对SFRP5的表观遗传学沉默可能导致SFRP5在胎盘组织阴性表达。因此，与PE相关的血清SFRP5水平增高可能并非来源于胎盘。脂肪组织是一个高度活跃的SFRP5分泌组织，并通过产生炎症介质与PE相关的炎症状态相关[17]。因此，假设血清中SFRP5的增加可能来自于PE患者的脂肪组织，然而，本研究仅检测了SFRP5的蛋白表达，未研究mRNA的转录和启动子甲基化，需要进一步的大规模基因转录相关研究来进一步解释其血清升高的原因。

Wnt通路调控许多发育过程，包括细胞命运的规范和细胞极性。而在疾病病理过程中，Wnt信号与癌细胞和滋养细胞的增殖及转移有关[18]。MMP-2和MMP-9是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶点[19]。作为Wnt抑制剂，SFRP5在胚胎和内胚层发育过程中抑制典型和非典型的Wnt信号传导途径[20]。由β-catenin的聚集和核转位激活的经典Wnt信号，促进滋养细胞的侵袭性分化[21]。有研究发现，在癌细胞和多能干细胞中，SFRP5通过降低磷酸化GSK3β和非磷酸化β-catenin(活性β-catenin)及随后的T细胞转录因子4(TCF4)/淋巴增强子结合因子1(LEF1)介导的基因表达，使Wnt/β-catenin信号途径失活[22]。由于早期胎盘滋养细胞的侵袭行为与肿瘤细胞相似，假设SFPR5可能对它们的功能有类似的影响。在体外实验中利用SFRP5重组蛋白，发现SFRP5通过增加GSK3β和降低β-catenin的水平来抑制滋养细胞的迁移和侵袭。进一步的研究发现，SFRP5可降低MMP-2和MMP-9的活性。而MMP-2和MMP-9作为Wnt/β-catenin信号通路的下游蛋白酶，可通过分解蜕膜细胞外基质促进滋养细胞的迁移和侵袭。这些结果提示，SFRP5可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路及其下游MMP2/9的活性对滋养细胞迁移和侵袭能力产生抑制作用。

本研究发现LiCl处理可促进HTR8/SVneo滋养细胞的迁移和侵袭，并上调β-catenin的表达。与SFRP5相似，Dkk-1抑制了滋养细胞的迁移和侵袭能力及经典Wnt/β-catenin通路。此外，SFRP5和Dkk-1可减弱LiCl的效应。总之，本研究结果表明，SFRP5的过度激活可能通过抑制Wnt/β-catenin途径在HTR8/SVneo滋养细胞功能障碍中发挥关键作用。

综上所述，SFRP5可能通过负向调控Wnt/β-catenin途径和下游的MMP-2和MMP-9，抑制HTR8/SVneo滋养细胞的迁移和侵袭，导致HTR8/SVneo滋养细胞功能障碍和PE的发生发展。因此，本研究的结果从一个新的角度仔细研究了PE的发病机制，并在未来为PE提供了新的治疗靶点。