SALL4 表达水平与卵巢癌患者化疗后疾病进展风险的相关性

唐佳雯，方来福，陈芳，丛玲华

宁波大学附属人民医院病理科，浙江宁波 315040

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是一组在组织病理学、形态学和分子学上具有异质性的肿瘤，是女性妇科恶性肿瘤相关死亡的主要原因[1]。相关研究发现，由于卵巢癌症状的非特异性以及缺乏既定的筛查测试，导致75%的患者被诊断时已为晚期[2]。尽管EOC 是对化疗最敏感的实体瘤之一，并且通常对顺铂/紫杉醇治疗显示出较高的初始反应，但仍有60%晚期患者化疗后5 年内出现疾病进展[3]。肿瘤进展是由肿瘤细胞与其微环境之间复杂的相互作用协调的，阐明卵巢癌发病机制的分子机制，对早期诊断和治疗，以改善患者的预后具有重要意义。

人类婆罗双树样基因4（spalt-like transcription factor 4，SALL4）是一种在胚胎干细胞中表达的锌指转录因子，在调控发育、胚胎发生、器官发生及自我更新和多能性的保存中发挥重要作用。SALL4的表达在大多数成人组织中被沉默，而其表达在各种类型的癌症中被重新激活，例如肺癌、胃癌等[4-5]。研究表明，SALL4 在卵巢癌细胞系和生殖细胞肿瘤中的mRNA 和蛋白质水平高表达[6]，SALL4 的过表达可以通过靶向上皮间质转化来增加癌细胞的增殖、迁移和侵袭[7]。此外，SALL4 的高表达与低生存率相关，并且已被视为神经胶质瘤患者的预后因素[8]，这些结果均表明SALL4 与肿瘤预后相关。卵巢癌是异质性疾病，化疗获益情况和预后也会不同，故深入了解SALL4 是否与卵巢癌患者化疗后疾病进展风险有关或可为该类患者的防治提供理论依据。因此，本研究通过探究SALL4 表达水平与卵巢癌患者化疗后疾病进展风险的关系，旨在进一步明确SALL4 对疾病进展的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年1 月至2021 年10 月于宁波大学附属人民医院进行化疗的94 例卵巢癌患者进行随访，截至2022 年5 月1 日，最终89 例获得随访，根据化疗后是否出现疾病进展分为进展组（n=49）和无进展组（n=40）。纳入标准：①符合《2018NCCN 卵巢癌包括输卵管癌及原发性腹膜癌临床实践指南》[9]关于上皮性卵巢癌诊断标准，均行根治性手术且经术后病理学检查确诊；②原发性卵巢癌；③年龄18～65 岁；④未接受过其他治疗；⑤未见其他部位肿瘤者；排除标准：①合并宫颈糜烂、宫颈炎等妇科疾病者；②合并凝血功能障碍等血液系统疾病；③合并免疫功能异常者；④严重的脏器功能障碍者；⑤预计生存期<12 个月者。本研究经宁波大学附属人民医院伦理委员会批准（伦理审批号：2021 年伦审科研第074 号），所有患者及家属均签订知情同意书。

1.2 方法

收集患者年龄、体质量指数（body mass index，BMI）、卵巢癌家族史、肿瘤位置、肿瘤直径、FIGO分级、分化类型、组织学分级、淋巴转移、血管侵犯、周围神经侵犯、远处转移、绝经状态等基线资料。所有患者均根据《2018 NCCN 卵巢癌包括输卵管癌及原发性腹膜癌临床实践指南》[9]制定手术方案，术后根据患者病理分型予以化疗，选择紫杉醇/顺铂、紫杉醇/卡铂、多烯紫杉醇/卡铂、卡铂/脂质体阿霉素。所有患者均进行6 个周期的化疗治疗。

本研究以患者出现疾病进展为观察终点，若随访期间未发生终点事件，则以最终随访截止事件为观察终点，为查阅住院、门诊电子病历系统病案记录或电话方式进行随访，随访截止时间为2022 年5 月1 日。本研究严格参照纳入和排除标准选择符合要求的患者，确保纳入研究的患者资料真实可信，经专门人员收集患者一般资料并核对是否与患者身份信息匹配，对数据进行平行双录入，保证数据输入准确无误。

1.3 观察指标

1.3.1 实验室指标 ①血常规：所有患者均于化疗前抽取静脉血，记录患者的淋巴细胞计数、中性粒细胞计数，计算中性粒细胞与淋巴细胞的比率（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）；②肿瘤标志物检查：所有患者均于化疗前抽取静脉血，经离心后取上清液，采用电化学发光法检测糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）；③S ALL4和人附睾蛋白4（human epididymal protein 4，HE4）表达水平：肿瘤组织石蜡切片采用二甲苯进行脱蜡至水，置于5%的双氧水常温孵育10min 后于磷酸盐缓冲液孵育5min，蒸馏水冲洗3 次（5min/次），5%的山羊血清抗体封闭10min，滴加一抗（英国Abcam公司；批号：20 199304；浓度为1:500），4℃冰箱孵育，蒸馏水冲洗3 次（5min/次），滴加二抗（北京康泰生物；批号：20 194856；浓度为1:1000），37℃孵育30min，蒸馏水冲洗3 次（5min/次），滴加第二代辣根酶标记的工作液体，37℃孵育10min，蒸馏水冲洗3 次（5min/次），显色后采用乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片，镜下观察。染色强度评分如下：0 分（阴性）、1 分（弱）、2 分（中等）和3分（强）。染色程度根据阳性染色细胞的百分比评分：0 分（<5%）、1 分（5%～25%）、2 分（26%～50%）、3 分（51%～75%）、4 分（76%～100%)。最终的免疫组化染色得分=强度分数×数量分数。

1.3.2 随访及化疗后疾病进展的评估 化疗后随访观察1 年，通过影像学检查方法评估疾病是否进展。完全缓解：所有可见病灶完全消失；部分缓解：病灶缩小≥30%，且无新发病灶；疾病稳定：病灶无变化；疾病进展：病灶增大≥20%，且出现新发病灶[10]。

1.4 统计学方法

所有数据均采用R(4.0.5)和SPSS 22.0 软件进行统计分析，计数资料采用例数（百分比）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用均数±标准差（）表示，两组组间比较采用独立t检验；采用Logistic 回归分析影响卵巢癌患者化疗后疾病进展的相关因素。通过受试者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线下面积评估SALL4、HE4、NLR 对卵巢癌患者化疗后疾病进展风险的预测价值，P<0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 随访结果

截止2022 年5 月1 日，最终89 例获得随访，其中49 例（55.06%）患者疾病存在进展，40 例（44.94%）未发生疾病进展。

2.2 临床资料比较

两组CA125、SALL4、HE4、NLR 比较，差异有统计学意义（P<0.05），余下临床资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 两组患者临床资料比较

2.3 化疗后疾病进展风险单因素及多因素Logistic回归分析

单因素 Logistic 分析显示，SALL4、HE4、NLR 为影响卵巢癌化疗后疾病进展的相关因素，见表2。多因素Logistic 分析显示，SALL4、HE4、NLR 为卵巢癌化疗后疾病进展的独立危险因素，见表3。

表2 化疗后疾病进展风险单因素Logistic 回归分析

表3 化疗后疾病进展风险多因素Logistic 回归分析

2.4 对卵巢癌患者化疗后疾病进展风险的预测价值

ROC 曲线显示，SALL4、HE4、NLR 能够预测卵巢癌患者化疗后疾病进展风险。见表4、图1。

表4 SALL4、HE4、NLR 预测卵巢癌患者化疗后疾病进展风险的曲线下面积比较

图1 SALL4、HE4、NLR 对卵巢癌患者化疗后疾病进展风险预测价值的ROC 曲线

3 结论

卵巢癌是妇科癌症相关死亡的主要原因之一，相关研究发现晚期诊断和治疗后复发癌症是卵巢癌患者高死亡率的最重要原因[11]，揭示卵巢癌发病机制中涉及的分子机制可能有助于寻找卵巢癌的新生物标志物。SALL4 是胚胎干细胞自我更新和维持多能性所必需的癌胚蛋白，在早期胚胎发育中起关键作用。研究显示，恢复SALL4 表达可在各种肿瘤中检测到并在癌症发生中表现出致癌作用[12]。研究发现，SALL4 阳性与胃癌进展相关的临床病理参数相关，可用于预测胃癌的预后[13]。Di 等[14]发现SALL4高表达的早期宫颈癌患者的5 年生存率明显低于SALL4 低表达的患者。以上研究均说明SALL4 与肿瘤患者的预后密切相关。EOC 的不同组织学亚型在对治疗和结果的反应方面存在差异，术后辅助化疗的预后也不同，分析卵巢癌组织内SALL4 的水平或可有助于预测卵巢癌患者化疗后疾病的进展，为评估卵巢癌患者化疗后疾病进展提供一个新的生物学指标。

最近研究表明，肿瘤的发生和发展都与肿瘤细胞中细胞增殖和凋亡的失衡有关，当细胞凋亡停止或增殖超过细胞凋亡时，肿瘤就会生长[15]，已有研究证明SALL4 对于调节肿瘤细胞中的细胞增殖和细胞凋亡至关重要[16]。Yang 等[17]发现SALL4 的沉默可导致慢性髓性白血病细胞中的细胞周期停滞和诱导细胞凋亡。Tan 等[18]发现肝癌细胞中的强制SALL4表达则会促进细胞增殖并减少G1 期细胞群。本研究结果显示，SALL4 为卵巢癌化疗后疾病进展的独立危险因素，可能是由于SALL4 的沉默抑制了细胞增殖并诱导了G0/G1 期的细胞周期停滞，进而起到了调节卵巢癌细胞周期的作用，从而达到调节细胞增殖和肿瘤生长目的。另外，Sun 等[19]发现SALL4 可对Akt/GSK-3β 信号传导和血管内皮生长因子表达的激活产生影响，起到修剪肿瘤血管并抑制肿瘤生长的作用，从而使接受化疗的卵巢患者受益。此外，Chen 等[20]发现SALL4 的沉默增加了凋亡细胞的数量，降低了Bcl-2 等抗凋亡因子的表达，并增加了Bax、cleaved Caspase-3 和cleaved-PARP 等促凋亡因子的表达，表明SALL4 可能在卵巢癌细胞凋亡中发挥抑制作用，从而调节肿瘤生长，延缓疾病进展。

HE4是一种高度敏感和特异性的卵巢癌标志物，已通过基因组学和蛋白质组学筛查确定，但其在卵巢癌恶性生物学行为中的作用仍存在争议。有研究报道HE4 可促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移[21]，但Kong 等[22]提出了相反的结论，表明HE4 可通过调节MAPK/PI3K/AKT 通路来抑制细胞增殖，在卵巢癌进展中发挥保护作用。本研究结果显示HE4 为卵巢癌化疗后疾病进展的独立危险因素，可能是由于卵巢癌组织内HE4 可通过激活JAK/STAT3 通路促进 p-Smad3 和Snail 的表达，进而增强了转化生长因子-β 诱导的上皮间充质转化，从而促进癌细胞增殖、侵袭和迁移。另外，Li 等[23]发现HE4 可通过调节ERK/MAPK 和基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶2 和组织蛋白酶B 的表达来影响细胞周期（G0/G1期），从而刺激卵巢癌的侵袭性细胞生长和恶性进展。

NLR 可反映各种疾病的严重炎症、危重疾病和死亡率。研究显示，恶性肿瘤引起的全身性炎症通常表现为外周血中性粒细胞增多、血小板增多和相对淋巴细胞减少，导致NLR 升高[24]。本研究结果与其相似，发现NLR 为卵巢癌化疗后疾病进展的独立危险因素。可能是由于中性粒细胞通过释放一氧化氮合酶或精氨酸酶来抑制CD8+T 淋巴细胞抗肿瘤反应，从而减弱免疫系统[25]。同时，较低的淋巴细胞计数可能与原发性免疫缺陷的存在有关。淋巴细胞减少可能意味着淋巴细胞介导的对恶性肿瘤的免疫反应差，因此疾病进展的可能性增加。

为进一步明确SALL4、HE4、NLR 与卵巢癌患者化疗后疾病进展风险的相关性。本研究绘制ROC曲线发现SALL4、HE4、NLR 能够预测卵巢癌患者化疗后疾病进展风险，证明SALL4、HE4、NLR 对卵巢癌患者化疗后疾病进展风险的预测价值。

综上所述，本研究证实SALL4、HE4、NLR 对卵巢癌患者化疗后疾病进展过程中起重要作用，且对疾病进展具有一定预测价值。但本研究仍存在不足之处，本研究的样本量小，易出现统计学偏差；另外，由于条件和时间限制，SALL4、HE4、NLR对化疗后肿瘤组织的作用机制未进行深入研究，后期需通过动物实验进行深入研究。