外泌体促脑血管新生机制探讨

朱立平，汤子钦，杨士运

广西中医药大学 广西南宁 530000

脑血管病是一种脑部血液循环障碍所致神经功能缺损的疾病，其起病急、进展迅速，易造成神经元坏死和凋亡、血-脑屏障通透性改变、胶质细胞及血管内皮细胞损伤等[1]，多数情况会遗留后遗症，有着极高的复发及致残率，不仅严重影响患者后期生活质量，也给家庭造成极其沉重的负担。因此，血管再生和神经的修复变得尤为关键。近年来关于外泌体的研究越来越多，它不仅在血管发育、生长和成熟过程中有着重要作用，同时，可以作为载药工具、透过血脑屏障，在血管生成或再生医学相关疾病中具有广阔的治疗前景。

外泌体的特点

外泌体（Exos）是一种从网织红细胞中分离出来的含多种活性酶的物质[2]，它是直径为30～100nm的微小囊泡状结构[3]，它不仅包含来自细胞内的脂质、多种蛋白质、RNA等生物活性物质[4]，如miRNA、信 使RNA （messenger RNA，mRNA）、转 移 蛋 白 质和RNAs，而且也含有细胞表面标记物CD9、CD63、CD81、CD82等[5-6]，在细胞之间通讯中充当载体角色。其分布非常广泛，可以由多种细胞分泌，也可以从多种体液中分离出来[7]。目前，外泌体已在许多疾病的诊断及治疗有深入研究，尤其是对干细胞源性外泌体及微小RAN的研究颇多，且应用广泛。

脑缺血与血管新生

动物实验研究表明，在脑缺血的24h内，内皮细胞数量开始增加，随后48～72h缺血半暗带出现大量增殖[8]，并且由缺血半暗带向梗死区进行延伸，形态学显示，随着时间的推移，微血管的数量也逐渐增多，新生成的血管可以形成新的侧支循环，以改善局部脑组织的缺血缺氧情况，从而有助于局部神经功能的恢复。血管新生过程极其复杂，受多种调节因子、酶、细胞共同调节，如血管内皮生长因子（VEGF）[9-11]、血管生成素（Ang）[12-13]、促红细胞生成素（EPO）[14]、神经纤毛蛋白（NPs）[15]、骨髓间充质干细胞（MSCs）、内皮祖细胞（EPCs）、低氧诱导因子1（ HIF-1）等，其中VEGF是促进血管生成的关键调控因子[16]。脑缺血后血管新生是由血管生成相关细胞、血管生长相关因子及生物环境间共同相互作用的结果，其过程均受严密调控，存在诸多不稳定因素，且相关实验较少，主要以信号通路作用、干细胞、中药等为主。外泌体与之对比，其作用有过之而无不及，不仅保留原有细胞信息不变，同时能够介导细胞间信息传导及交流，而且能透过血脑屏障、克服易降解及跨膜能力不足、减少诱导凋亡、充当载体等优势，为促血管新生提供新的途径，本文通过阅读相关文献对其促血管新生机制进行探讨。

外泌体促脑血管新生机制

1 内皮祖细胞（EPCs）来源外泌体

随着对内皮祖细胞的不断深入研究发现，EPCs是可以分泌Exos参与血管新生。Pang等[17]在人类肾动脉外膜中发现了一种具有EPCs样特征的细胞群，经实验证实为肾动脉源性血管祖细胞（renal artery-derived vascular progenitor cells，RAPCs），且体外RAPCs所表达的miR-218在血管新生过程中能够增强RAPCs促进血管内皮细胞（ECs）再生潜力的能力，揭示了RAPCs有助于ECs修复的潜在机制，然而miR-218在RAPCs的Exos中的表达却存在一定的差异性，具体还需更多的实验去验证。Ma等[18]利用缺氧/再复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）损伤的ECs模型发现，EPCs-Exos对ECs具有抗氧化、凋亡的作用，能显著改善H/R受损的血管生成功能，而高表达miR-132-3p的MSC-Exos通过激活PI3K/Akt信号通路使H/R诱导受损脑血管内皮细胞一些生理功能得到改善[19]。

2 成纤维细胞来源性外泌体

研究发现，胆脂瘤基质的成纤维细胞分泌的外泌体（hCPFs-Exos）也能够促血管内皮细胞增殖发挥血管新生作用[20]。

3 间充质干细胞源性外泌体

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有潜在的多分化功能，通过使ECs增殖、迁移达到血管新生，对一些缺血性疾病有很好的疗效[21]，而由外泌体所分泌的具有含外泌体特性作用的MSC，可作为信号分子介导细胞之间的信息传导，具有血管新生的作用[22]。通过低氧环境的诱导，使MSCs来源的外泌体中miR-214表达显著并抑制ATM基因的表达促使血管新生[23]。miRNA-21很可能是人脐带间充质干细胞（uMSCs-Exos）促血管新生的非常关键的物质，其可能是通过调节NOTCH1/DLL4/VEGFA信号通路来提高内皮祖细胞有效转化率而实现明显促血管新生的作用[24]。Tancharoen等[25]在人羊水MSC血管生成实验中，MSC不仅可以通过自身分化为血管ECs，也可分泌VEGF、基质细胞因子－1等多种生长因子来调节内皮系的干/祖细胞向成熟内皮细胞分化有助于血管新生[26]。另外，Shabbir A[27]等通过研究发现，MSCs来源的外泌体通过AKT、ERK1/2和STAT3t信号通路来激活多种调节因子促进血管内皮细胞生成，从而有利于血管新生。来源于MSC的外泌体也可通过细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（extracellular matrix metalloproteinase in-ducer，EMMPRIN）产生强大的血管生成能力[28]。还有一些研究发现，通过静脉输注尿源性干细胞来源的外泌体USCs-Exos可促使缺血区域脑组织血管新生并抑制该区域细胞凋亡，从而改善脑卒中后神经功能恢复[29]。人嗅觉黏膜间充质干细胞OMMSCs外泌体通过HBMECs增殖、迁移及管样结构形成促进血管新生[30]。中性粒细胞来源外泌体通过增强hBMSC、HUVEC成血管相关因子表达来增强hBMSC、HUVEC迁移能力、增殖能力，以及HUVEC成管效果，OM-MSCs外泌体/水凝胶复合物可有效提高体内血管生成能力[31]。因此干细胞促血管新生的能力超强，未来还需要大量的临床实验去深入研究。

4 miRNA

miRNA在外泌体发挥促血管生成作用过程中扮演重要角色，其机制主要通过促进血管内皮细胞的增殖、迁移并抑制缺氧诱导因子抑制因子（ FIH） 来促使血管生成。有研究表明，通过下调PI3KR2既是miR-125激活P13K促血管新生的方法，也是VEGF血管新生过程中Akt/PKB磷酸化的必要环节[32]。miR-126是ECs功能和血管生成的重要调节器，MSCEXos可以通过向ECs提供miR-126增强H/R受伤ECs的生存和血管功能，并随后激活PI3K/Akt/eNOS通路，减少裂开的黄斑-3表达，增加血管生成和生长因子[33]。Liang X等[34]通过对脂肪组织间充质干细胞（ADMSCs）源性外泌体研究发现，其中miR-125a能通过抑制Notch配体4蛋白的表达来有助于血管新生。由脂肪衍生干细胞分泌的外泌体通过miRNA-181b/TRPM7轴体外缺氧后也有利于脑微血管内皮细胞的血管生成[35]。人参皂苷（G-Rg1）可促使外泌体中的miRNA-126-5p、miRNA-146a-5p、miRNA-210、miRNA-214-5p等与血管新生相关物质表达显著增多，这说明G-Rg1能通过外泌体的水平促进血管 新生[23]。

外泌体载药促脑血管新生

1 外泌体载中药促脑血管新生

随着中药在促进血管新生相关疾病的治疗方面积累丰富经验，研究发现脑微血管ECs有分泌Exos的作用，并且对其蛋白分析发现有几种受体能够携带大分子通过血脑屏障。载有补阳还五汤有效成分的MSCs来源的外泌体，通过激活VEGF上调miR-126以及下调miR-221、miR-222的表达，促使血管增生、侧支循环的建立，改善组织缺血缺氧、减轻卒中症状[36]。中药淫羊藿其活性成分主要是淫羊藿苷，现代有研究表明，淫羊藿苷不仅可以显著提高缺氧条件下MSC的增殖活性，抑制细胞凋亡，同时还能提高多种促血管生成相关miRNA在细胞和外泌体的表达，有助于内皮细胞内环境稳定和血管新生[37]。Li等[38]通过研究发现骨髓MSC移植同川芎嗪联合治疗后，能显著上调SDF-1和CXC趋化因子受体4的表达，并促使骨髓MSC向脑内缺血区归巢，协同增加BDNF和VEGF的表达，有助于血管新生。刘婉莹[39]通过芎归方协BMSCs-exosomes调控缺血性脑卒中血管新生的实验研究发现，芎归方可以调控微环境改善脑组织炎症反应，也可以通过PI3K/Akt/mTOR/p70S6通路协同调控短暂性大脑中动脉闭塞缺血（tMCAO）大鼠促使血管新生，使缺血性脑损伤后大鼠神经功能得到修复，为载药提供了新的依据，具体详细机制需要进一步临床实验验证[40]。

2 外泌体载药物钛

外泌体也可以载相关药物钛促使脑血管新生。Zhang等[41]将c（ RGDyK） 肽与含miR-210（胆固醇修饰）外泌体联合，向短暂性大脑中动脉闭塞（ middle cerebral artery occlusion） 小鼠模型给药，发现VEGF的表达明显上调，同时也观测到血管内皮细胞增殖、病变区血管密度增加，揭示了存在血管新生现象。

小 结

外泌体作为细胞来源的产物，不仅含有母细胞的生物学信息、能够介导细胞间信息传导及交流，而且具有利于制造、储存、调配、保护、高生物活性、能透过血脑屏障、克服易降解及跨膜能力不足、减少诱导凋亡及免疫介导排斥等特点，而特定细胞分泌的外泌体通过相关作用机制可以促进脑血管新生，其中间充质干细胞、内皮祖细胞、miRNA在促血管新生方面扮演着重要的角色。作为载体，与一部分中药及药物钛结合可以促使血管新生，对再生医学或血管生成相关疾病的治疗极具应用前景。从中医药研究层面来看，外泌体载药与引经药的作用有类似之处，或许可以为中医学理论的发展添砖加瓦，但就目前而言，仍有许多机制尚未阐明，如外泌体的运输、摄取、调控、作用靶点等许多方面都有待进一步研究论证。综上所述，外泌体不仅自身可促使脑血管新生，同时作为载体也可促进脑血管新生，为临床的治疗、药物的研发、中医理论体系的发展提供更为宽广的思路。