结直肠癌组织中miR-767-3p表达水平与上皮-间质转化的关系分析

陈敏洋

结直肠癌（CRC）为具有高隐匿性、低长期生存率特点的常见恶性肿瘤，是全球癌症相关性死亡的主要原因[1]。尽管肿瘤的诊疗技术在不断发展，但CRC 的治愈率和长期生存率并没有显著的提高[2]。结直肠癌导致死亡的主要原因是远处转移，预计约60%的结直肠癌患者会出现转移[3]。肿瘤转移是一个高度复杂的多步骤过程，并且与上皮-间质转化（EMT）密切相关[4]。而miRNA为动植物中广泛存在的非编码RNA[5]。目前许多研究发现，在各种疾病包括肿瘤的发生、发展、转移中，各种miRNA 参与其中。有研究证实，CRC的miRNA 差异表达谱中miR-767-3p 明显高表达，且具有一定的诊断价值[6]。而miR-767-3p 的表达是否参与癌细胞的浸润和转移有待探讨，可通过研究癌细胞EMT 的程度分析。本研究通过观察结直肠癌细胞和癌前细胞的miR-767-3p、EMT 相关蛋白表达情况及患者的病理特征，分析、推测结直肠癌组织中miR-767-3p 表达水平、EMT 及癌组织侵袭和转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取江西省中西医结合医院病理科2017 年1 月-2021 年12 月收治的70 例结直肠癌患者的癌组织、癌旁正常组织石蜡标本及相关的临床资料纳入研究。男39 例，女31 例，年龄30～95 岁，平均（56.24±5.96）岁。其中结肠癌33 例，直肠癌37 例；TNM 分 期：Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ期分别4/29/22/15 例。诊断标准：参照文献[7]《中国结直肠癌诊疗规范（2015 版）》中结肠癌或直肠癌的诊断标准。纳入标准：符合上述标准且经病理学诊断确诊为CRC；活检前未经过放化疗治疗；根据影像手段、CRC 手术和病理组织可以明确肿瘤的癌体位置、浸润深度及转移情况。排除标准：合并其他肿瘤；严重肝肾功能损害。

1.2 方法 收集患者结直肠癌组织和癌旁正常组织包埋在石蜡中，冰冻层-20 ℃保存。（1）miR-767-3p水平检测：采用PCR 法检测组织miR-767-3p 表达[8]。使用TRIzol 试剂从组织中提取总RNA。用反转录试剂盒将提取的总RNA 逆转录为cDNA，后PCR 扩增仪中扩增，反应体系20 μL，反应条件为预变性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，扩增60 ℃44 s，40 个循环，以U6 作为内部对照，以2-ΔΔCt法计算miR-767-3p 相对表达量。U6snRNA 引物序列：TTCGTGAAGCGTTCCATATrrT；miR-767-3p 引物序列：TCTGCTCATACCCCATGGTTTCT。（2）采用免疫组化法分别对E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Vimentin 的表达检测，操作方法：中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，烤片，然后酒精梯度洗脱。用pH8.0 EDTA 修复液进行高压加热抗原修复，TBST冲洗，冲洗后用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。切片滴加E-cadherin 抗体（ab40772）/N-cadherin 抗体（ab76011）/Vimentin 抗体（ab92547）/β-ccatenin抗体（ab32572）等单克隆抗体（均由北京中杉公司提供）。接着孵育1 h，用DAB 试剂染色，冲洗用苏木素复染后，脱水干燥，中性树胶固定。细胞胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。显微镜（×400）视野下观察阳性细胞百分比及染色强度，观察多个视野，以判定标准阳性细胞百分比评分与染色强度评分的乘积≥3 分为阳性表达。标准如下：阳性细胞按≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分别记为0、1、2、3、4 分；染色强度根据未染色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3 分。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0 统计软件处理数据，符合正态性分布的计量资料采用（）表示，两两比较行t检验，多分类的计量资料行F检验，多组两两比较行SNK-q检验；计数资料以率（%）表示，组间对比行χ2检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。定距和定类资料相关性分析，用单因素方差分析F检验，用η（eta）系数来度量关联强度，E2＞0.16，存在强相关；0.16≥E2≥0.06，存在中度的相关关系；E2＜0.06，相关程度比较微弱。

2 结果

2.1 癌组织和癌旁正常组织的miR-767-3p 和EMT指标 结直肠癌患者的癌组织中miR-767-3p 表达量明显高于癌旁正常组织，E-cadherin 阳性率明显低于癌旁正常组织，N-cadherin 阳性率、β-catenin阳性率、Vimentin 阳性率均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 癌组织和癌旁正常组织的miR-767-3p和EMT指标

2.2 结直肠癌组织中miR-767-3p 和EMT 相关蛋白的表达 以CRC 癌组织中的miR-767-3p 表达的中位数（4.63）为界限值，将CRC 患者分为miR-767-3p 高表达组和低表达组。E-cadherin（+）的miR-767-3p 表达量明显低于E-cadherin（-），且miR-767-3p 高表达组的E-cadherin（+）比例显著低于低表达组（P＜0.05）；N-cadherin（+）的miR-767-3p 表达量明显高于N-cadherin（-），且miR-767-3p 高表达组的N-cadherin（+）比例显著高于低表达组（P＜0.05）；β-catenin（+）的miR-767-3p 表达量明显高于β-catenin（-），且miR-767-3p 高表达组的β-catenin（+）比例显著高于低表达组（P＜0.05）；Vimentin（+）的miR-767-3p 表达量明显高于Vimentin（-），且miR-767-3p 高表达组的Vimentin（+）比例显著高于低表达组（P＜0.05）。见表2、3。

表2 结直肠癌组织中EMT相关蛋白的不同表达的miR-767-3p表达量比较（）

表2 结直肠癌组织中EMT相关蛋白的不同表达的miR-767-3p表达量比较（）

表3 miR-767-3p高表达组、低表达组EMT相关蛋白的表达比较[例（%）]

2.3 miR-767-3p 在不同临床病理特征结直肠癌组织中的表达 不同浸润深度的肿瘤组织miR-767-3p 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），且在miR-767-3p高表达组和低表达组上的分布差异无统计学意义（P＞0.05）；肿瘤的不同分化程度、转移情况和TNM 分期的miR-767-3p 比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；高分化的肿瘤的miR-767-3p 表达量显著低于中、低分化的肿瘤（P＜0.05）；而在miR-767-3p 高表达组中，低分化程度的肿瘤比例（45.71%）比低表达组（11.43%）更高；有肿瘤转移的癌组织中miR-767-3p 表达量更高，而miR-767-3p 低表达组中无肿瘤转移的比例（85.71%）更高；TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期的癌组织中miR-767-3p 表达量显著高于Ⅲ期和Ⅳ期，且高表达组中Ⅰ～Ⅱ期比例（54.29%）明显更高。见表4、5。

表4 不同临床病理特征结直肠癌组织中的miR-767-3p表达

2.4 结直肠癌组织的miR-767-3p 表达量与上皮-间质转化、肿瘤病理特征的关系及相关程度 癌组织中miR-767-3p 表达量与E-cadherin、N-catenin、Vimentin 表达存在相关关系（P＜0.05），且E2＞0.16，相关程度强；癌组织中患者的miR-767-3p 表达量与β-cadherin 表达存在相关关系（P＜0.05），0.16≥E2≥0.06，存在中度的相关关系。癌组织中患者的miR-767-3p 表达量与肿瘤分化程度、TNM 分期存在相关关系（P＜0.05），且E2＞0.16，相关程度强；癌组织中患者的miR-767-3p 表达量与肿瘤的转移情况存在相关关系（P＜0.05），0.16≥E2≥0.06，存在中度的相关关系；癌组织中患者的miR-767-3p表达量与浸润深度无相关关系（P＞0.05）。见表6。

表5 miR-767-3p高、低表达组的临床病理特征比较[例（%）]

表6 miR-767-3p与不同EMT蛋白、侵袭和转移的相关程度

3 讨论

miRNA 为长度在19～30 个核苷酸之间的非编码RNA，参与各种生物学和病理过程，包括肿瘤细胞增殖、存活、凋亡和肿瘤发生[5]。在过去二十年里，大量研究发现疾病都有特殊的miRNA 表达谱，与正常组织中的表达不同，这些差异同时在癌症中发现，因此miRNA 目前作为基因表达调节剂被广泛研究癌症的新诊断标志物和治疗靶点[9-11]。miR-767 可根据核苷酸的排列分为miR-767-3p 和miR-767-5p，后者目前在国外广泛用于寻找肿瘤的新治疗靶点，而miR-767-3p 在肿瘤方面的研究的相关报道较少。但有研究发现CRC 患者的癌细胞和外周血组织中miR-767-3p 相对健康人群高表达[12]。EMT 是肿瘤细胞恶性过程，侵袭和转移的重要机制之一，主要表现为上皮细胞形态、细胞极性和紧密连接丧失，细胞间黏性降低，以及向具有侵袭性和转移性能力的间质细胞形态的转化[13]。因此本研究通过对CRC 患者的病理标本检测观察miR-767-3p、EMT 相关蛋白表达情况并结合患者的病理特征，分析miR-767-3p 的不同表达与癌组织的侵袭和转移的关系。

在本研究中，CRC 患者癌组织和癌旁正常组织中miR-767-3p、E-cadherin 阳性率、N-cadherin 阳性率、β-catenin 阳性率、Vimentin 阳性率均有显著性差异，癌组织中miR-767-3p 表达水平高于癌旁正常组织中，EMT 蛋白的表达异常均倾向EMT过程变化。说明在CRC 患者癌组织不同于癌旁正常组织，出现了miR-767-3p 高表达和EMT 过程。这结果与刘霞等[12]的研究相符，且提供了进一步研究的基础。

在本研究中，癌组织患者EMT 各蛋白不同表达下的miR-767-3p 的表达量均显著不同，E-cadherin（+）者miR-767-3p 的表达量明显更低，N-cadherin（+）者、β-catenin（+）者、Vimentin（+）者miR-767-3p 的表达量均明显更高，体现不同miR-767-3p 表达量的癌组织与EMT 的进程有所不同。以CRC 癌组织中的miR-767-3p 表达的中位数4.63 为界限值，将CRC 患者分为miR-767-3p高表达组和低表达组，EMT 各蛋白的表达在高表达组和低表达组上分布有显著差异，高表达组的E-cadherin 阳性率更低，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin 阳性率更高。在相关性分析中，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 与miR-767-3p的表达都有强相关性，β-catenin 与miR-767-3p 的表达中等相关，以上结果均可表明miR-767-3p 的高表达很可能与EMT 过程有关。在肿瘤中EMT 通常表现为E-钙黏蛋白转化为N-钙黏蛋白，这种转化表现为上皮细胞标志物（E-cadherin）的下调表达和间充质细胞标志物（N-cadherin 和Vimentin）的上调表达，同时可能出现β-catenin 的入核，激活Wnt/β-catenin 通路，这些蛋白是EMT 发生和发展的基本标志物[14-15]。有研究报告，E-cadherin、β-catenin、N-cadherin 和Vimentin 的表达与临床病理特征（如局部肿瘤分化和远处转移）和患者预后不良之间存在显著相关性[16-17]。与本研究中miR-767-3p、EMT 相关蛋白、肿瘤病理特征结果与上述描述相符。miR-767-3p 异常表达导致CRC 癌组织EMT 进展的具体作用的信号通路或基因上尚未明确，在其他肿瘤细胞（人黑色素瘤、胶质瘤、非小细胞肺癌）中，其通过靶向TET 基因，降低TET1和TET3 的活性，导致抑癌基因5-羟甲基胞嘧啶（5-mC）水平降低，调节肿瘤细胞DNA 甲基化，减少对E-cadherin 的保护和减少对Wnt/β-catenin 通路的抑制，诱发EMT 和转移[18-20]。

肿瘤病理方面，miR-767-3p 的表达与肿瘤的分化程度、TNM 分期强相关，具体表现为高分化的肿瘤的miR-767-3p 表达量显著低于中、低分化的肿瘤；而在miR-767-3p 高表达组中，低分化程度的肿瘤比例相比低表达组更高。TNM 分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者癌组织中miR-767-3p 表达量显著高于Ⅲ期和Ⅳ期，且高表达组中Ⅰ～Ⅱ期患者比例（54.29%）明显更高；总体表现为miR-767-3p 表达量越高，肿瘤分化越低，且Ⅰ～Ⅱ期患者多数miR-767-3p 高表达。结果与刘霞等[12]和刘寒梢等[21]研究相符。具体机制可能与上述miR-767-3p 高表达诱发EMT 和转移有关。

综上所述，miR-767-3p 高表达与上皮-间质转化密切相关，同时与肿瘤的病理特征有关，推测癌组织中miR-767-3p 表达水平升高可能通过促进EMT 发生导致癌组织侵袭和转移，但具体机制还有待后续研究证明。