CAV3 介导骨骼肌和心肌细胞的IMGU 和NIMGU

周彩霞，吕 倩，卜晓阳，田一夫，冼 晶，黄媛恒，杨立会，黄 勤

（1.广西医科大学基础医学院生理学教研室，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院内分泌科，广西 南宁 530021）

CAV3 蛋白是Caveolins 家族成员之一，是细胞膜微囊结构中的标志蛋白，它主要表达于肌肉细胞，包括骨骼肌、心肌和平滑肌细胞等［1］。CAV3 在维持微囊正常结构、细胞囊泡转运、离子通道开放和葡萄糖稳态等多种细胞功能的调节及内外信号转导通路的调控中起着关键作用［2］。在进食、升糖激素和胰岛素等影响下，机体的组织细胞生存在葡萄糖浓度剧烈变换的环境中。其中胰岛素的释放能显著提高肌细胞对葡萄糖摄取利用，使血糖下降。这种促进作用是通过CAV3 蛋白介导的肌细胞GLUT4 易位，从而提高葡萄糖摄取率［3，4］。在胰岛素不释放的情况下，肌细胞的葡萄糖利用是否还依赖CAV3 介导，有待了解。本研究选用C2C12 细胞和H9c2 细胞，通过转染CAV3 siRNA 使CAV3蛋白表达下降，在有胰岛素或无胰岛素存在时，观察细胞葡萄糖摄取和GLUT4 蛋白的表达，探讨CAV3 对IMGU 和NIMGU 的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

C2C12 细胞和H9c2 细胞分别购于湖北武汉中国典型培养物保藏中心、广西医科大学实验中心，DMEM、胎牛血清、opti-MEM 购于美国Gibco 公司，青链霉素混合液、马血清购于以色列BI 公司，胰岛素购于美国Sigma 公司，蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购于瑞士Roche 公司，Lipofectamine3000 购于美国Thermofisher 公司，葡萄糖检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，CAV3、GLUT4 单克隆抗体购于美国Santa Cruz 公司，GAPDH 单克隆抗体购于美国Immunoway 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分化 C2C12 细胞和H9c2 细胞分别保持在高糖DMEM 培养基和低糖DMEM 培养基中，并补充有10%胎牛血清和1%青链霉素混合液，置于含有5% CO2培养箱中37 ℃培养。其中待C2C12 细胞密度约90%时，吸弃细胞培养液，用PBS 洗涤2 次后，加入含有2% 马血清的高糖DMEM 培养基。隔天换一次液使细胞完成分化。

1.2.2 实验分组 按以下分组对C2C12 细胞和H9c2 细胞葡萄糖摄取和GLUT4 蛋白表达检测，（1）对照组（Control 组）：即无胰岛素，未转染CAV3 siRNA，（2）siRNA 组：无胰岛素，转染CAV3 siRNA，（3）Insulin 组：有胰岛素，未转染CAV3 siRNA，（4）Insulin + CAV3 siRNA 组：有 胰 岛 素，转 染CAV3 siRNA。

1.2.3 C2C12 细胞转染 由中国苏州吉玛基因股份有限公司设计合成的3 条CAV3 siRNA 序列，CAV3 siRNA - 1 正义链5' - GCUCGGAUCAUCAAGGACAtt - 3'，反 义 链 5' - UGUCCUUGA UGAUCCGAGCtt-3'，CAV3 siRNA-2 正 义 链5'-GCAUUAAGAGCUACCUGAUtt-3'，反 义 链5'-AUCAGGUAGCUCUUAAUGCtt-3'，CAV3 siRNA-3 正义链5'-GCUUCGACGGUGUAUGGAAtt-3'，反 义 链5'-UUCCAUACACCGUCGAAGCtt-3'。细胞以70%～80%的密度铺至6 孔板内，用不含青链霉素的细胞培养液培养24 h 后转染。按照Lipofectamine 3000（Invitrogen）的操作说明书进行转染，取两个EP 管，分别做标记为A、B。A 管内加入125 μL Opti-MEM 和5 μL Lipofectamine 3000；B 管内加入125 μL Opti-MEM 和3 μL siRNA。A、B 两管各静置5 min 后将两管内液体混合，再静置15 min 后加入孔板中，37 ℃培养箱培养，6 h 后每孔加10%胎牛血清继续培养24 h 和48 h。

1.2.4 H9c2 细胞转染 参考文献的相关信息［5］，由中国苏州吉玛基因股份有限公司合成CAV3 siRNA 产 品，CAV3 siRNA：正 义 链5'-GCGAUCACAUGUACUGUAAtt-3' ，反义链5'-UUACAGUACAUGUGAUCGCtt-3'。细胞以70%～80%的密度铺至6 孔板内，用不含青链霉素的细胞培养液培养24 h 后转染。按照Lipofectamine 3000（Invitrogen）操作说明书进行细胞转染，取两个EP 管，分别做标记为A、B。A 管内加入125 μL Opti-MEM和2 μL Lipofectamine 3000；B 管内加入125 μL Opti-MEM 和1 μL siRNA。A、B 两管各静置5 min 后将两管内液体混合，再静置15 min 后加入孔板中，37 ℃培养箱培养，6 h 后每孔加10%胎牛血清继续培养48 h。

1.2.5 倒置荧光显微镜观察观测转染效果 FAM绿色荧光标记的NC siRNA（中国苏州吉玛基因股份有限公司）转染H9c2 细胞和C2C12 细胞，转染条件和方法与目的基因相同，转染24 h 或者48 h 后用倒置荧光显微镜观察细胞中是否存在绿色荧光，与未转染的细胞比较，若转染后有荧光出现，则表示细胞转染成功。

1.2.6 葡萄糖摄取测定 参考文献报道的方法［4］，分别收集培养24 h 及48 h 细胞培养液至离心管中，2 500 r/min 离心10 min，取上清液，并根据南京建成葡萄糖检测试剂盒说明书检测细胞培养液中葡萄糖含量。葡萄糖摄取量（mmol/L）=无细胞培养基中葡萄糖含量-样本孔剩余葡萄糖含量。

1.2.7 Western blot 检 测CAV3、GLUT4 蛋 白 表 达量 取各组制备好的细胞，弃去培养基，PBS 冲洗3 次，加入预冷的裂解缓冲液（RIPA 裂解液：磷酸酶抑制剂：蛋白酶抑制剂=100∶1∶1），用细胞刮刮取裂解的细胞并将其收集至离心管中，12 000 r/min，4 ℃，离心30 min，收集上清并用BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白含量，将样品上清以4∶1 的比例与蛋白上样缓冲液混匀，沸水中煮5 min，SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF 膜上，转膜结束后用TBST 配制5%脱脂奶粉低速摇床上封闭1 h，TBST 洗 膜，CAV3（1∶100）、GLUT4（1∶100）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育过夜，TBST 洗5 次，每次5 min，选择合适种属的偶联HRP 二抗，避光孵 育2 h，用TBST 洗3 次，每 次10 min，使 用Li-Cor Odyssey 红外成像仪显影。Li-Cor Odyssey 红外成像系统分析软件计算每个条带的800 nm 红外信号的灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 CAV3 siRNA 转染抑制C2C12 细胞中CAV3蛋白表达

分别采用先分化后转染和先转染后分化的方法转染不同的CAV3 siRNA 至C2C12 细胞。用带有FAM 绿色荧光修饰的NC siRNA 转染C2C12 细胞24 h 或者48 h，转染方法和条件与CAV3 siRNA相同，转染后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光，提示转染成功（图1A、1B）。C2C12 细胞先分化5 d 使其成为成熟的骨骼肌细胞，将不同的CAV3 siRNA 序列分别转染C2C12 细胞并继续培养24 h 后提取总蛋白进行Western blot 检测CAV3蛋白表达，与NC 组相比，转染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 均使CAV3 蛋白表达降低，其中转染CAV3 siRNA-2 后CAV3 蛋白表达降低约33.3%（图1C、表1）。C2C12 细胞增殖至70%时开始转染，转染完成后继续培养48 h，待细胞增殖至90 %时分化培养6 d，Western blot 显示3 条CAV3 siRNA 序列均明显降低细胞中CAV3 蛋白的表达（P＜0.01），且CAV3 siRNA-2 效果最好，使CAV3 蛋白表达量降低约70.5%（图1D、表1）。上述结果显示先转染后分化细胞的干扰效果普遍高于先分化后转染的干扰效果，且CAV3 siRNA-2 效果最好，所以C2C12 细胞采用CAV3 siRNA-2 先转染后分化进行后续实验。

图1 C2C12 细胞的转染效果Fig 1 Transfection effect of C2C12 cells

表1 C2C12 细胞CAV3 蛋白表达情况（n=3，±s）Tab 1 Expression of CAV3 proteins in C2C12 cells（n=3，±s）

表1 C2C12 细胞CAV3 蛋白表达情况（n=3，±s）Tab 1 Expression of CAV3 proteins in C2C12 cells（n=3，±s）

注：与NC 组相比，**P＜0.01。

CAV3（先转染后分化）1.46±0.12 0.50±0.06**0.43±0.03**0.49±0.09**108.214 0.000组别NC CAV3 siRNA-1 CAV3 siRNA-2 CAV3 siRNA-3 FP CAV3（先分化后转染）0.18±0.03 0.15±0.04 0.12±0.02 0.14±0.02 2.478 0.136

2.2 CAV3 siRNA 转 染 抑 制H9c2 细 胞 中CAV3 蛋白表达

H9c2 细胞转染NC siRNA 后继续培养48 h 在倒置荧光显微镜下拍摄的绿色荧光图片提示H9c2细胞转染成功（图2A）。Western blot 结果显示CAV3 siRNA 转染能显著降低H9c2 细胞中CAV3蛋 白 的 表 达 量，降 低 约84.6%（P＜0.01）（图2B、表2）。

表2 H9c2 细胞CAV3 蛋白表达情况（n=3，±s）Tab 2 Expression of CAV3 proteins in H9c2 cells（n=3，±s）

表2 H9c2 细胞CAV3 蛋白表达情况（n=3，±s）Tab 2 Expression of CAV3 proteins in H9c2 cells（n=3，±s）

注：与NC 组相比，**P＜0.01。

CAV3 0.13±0.01 0.02±0.01**14.758 0.000组别NC CAV3 siRNA t P

图2 H9c2 细胞转染效果Fig 2 Transfection effect of C2C12 cells

2.3 CAV3 蛋白表达下降减少C2C12 细胞和H9c2细胞葡萄糖摄取

C2C12 细胞和H9c2 细胞分别在有或无胰岛素条件下培养48 h，结果显示有胰岛素时葡萄糖摄取比无胰岛素时分别增加约35%和30%，表明C2C12细胞和H9c2 细胞葡萄糖摄取同时存在IMGU 和NIMGU 两条途径，IMGU 途径使葡萄糖摄取效率更高。在C2C12 细胞中，无胰岛素条件下，CAV3蛋白表达下降使葡萄糖摄取减少约19%（P＜0.05），而在有胰岛素条件下，CAV3 蛋白表达下降使葡萄糖摄取减少约34%（P＜0.01）（图3A、表3），在H9c2 细胞中，在无胰岛素条件下，CAV3 蛋白表达下调使H9c2 细胞葡萄糖摄取降低约50%（P＜0.01），而在有胰岛素条件下，CAV3 蛋白表达下调使H9c2 细胞葡萄糖摄取降低约40%（P＜0.01）（图3B、表3），提示CAV3 参与C2C12 细胞和H9c2 细胞IMGU 和NIMGU。

表3 CAV3 蛋白表达下降对C2C12 细胞和H9c2 细胞葡萄糖摄取的影响（n=6，±s）Tab 3 Effect of decreased CAV3 protein expression on glucose uptake in C2C12 cells and H9c2 cells （n=6，±s）

表3 CAV3 蛋白表达下降对C2C12 细胞和H9c2 细胞葡萄糖摄取的影响（n=6，±s）Tab 3 Effect of decreased CAV3 protein expression on glucose uptake in C2C12 cells and H9c2 cells （n=6，±s）

注：与Control 组相比，*P＜0.05,**P＜0.01；与Insulin 组相比，##P＜0.01。

H9c2 细胞葡萄糖摄取组别C2C12 细胞葡萄糖摄取1.41±0.29 0.71±0.12**2.03±0.05 1.20±0.15##59.065 0.000 Control siRNA Insulin Insulin + CAV3 siRNA FP 3.07±0.43 2.48±0.27*4.74±0.36 3.12±0.64##28.046 0.000

图3 CAV3 蛋白表达下降对C2C12 细胞和H9c2 细胞葡萄糖摄取的影响Fig 3 Effect of decreased CAV3 protein expression on glucose uptake in C2C12 cells and H9c2 cells

2.4 CAV3 蛋白表达下降对C2C12 细胞和H9c2 细胞葡萄糖摄取关键蛋白GLUT4 的影响

在C2C12 细胞中，CAV3 蛋白表达下调能明显降低有或无胰岛素时C2C12 细胞GLUT4 蛋白表达差异具有统计学意义（P＜0.01）（图4A、表4）。在H9c2 细胞中，CAV3 蛋白表达下调能明显降低无胰岛素条件下H9c2 细胞中GLUT4 蛋白的表达，差异具有统计学意义（P＜0.05），对有胰岛素条件下H9c2 细胞GLUT4 蛋白有下调的趋势，但是无统计学意义（图4B、表4）。

图4 CAV3 蛋白表达下降对C2C12 细胞和H9c2 细胞GLUT4 蛋白的影响Fig 4 Effect of decreased CAV3 protein expression on GLUT4 protein in C2C12 cells and H9c2 cells

表4 CAV3 蛋白表达下降对C2C12 细胞和H9c2 细胞GLUT4蛋白的影响（n=5，±s）Tab 4 Effect of decreased CAV3 protein expression on GLUT4 protein in C2C12 cells and H9c2 cells （n=5，±s）

表4 CAV3 蛋白表达下降对C2C12 细胞和H9c2 细胞GLUT4蛋白的影响（n=5，±s）Tab 4 Effect of decreased CAV3 protein expression on GLUT4 protein in C2C12 cells and H9c2 cells （n=5，±s）

注：与Control 组相比，*P＜0.05,**P＜0.01；与Insulin 组相比，##P＜0.01。

H9c2 细胞GLUT4 0.06±0.01 0.04±0.01*0.07±0.01 0.05±0.01 4.041 0.026组别Control siRNA Insulin Insulin + CAV3 siRNA FP C2C12 细胞GLUT4 0.11±0.01 0.09±0.01**0.12±0.01 0.09±0.01##9.869 0.001

3 讨论

siRNA 是主要参与RNA 干扰（RNAi）现象的长度为20～25 bp 的双链RNA，能通过与目标基因或者目标基因的信使RNA 结合，抑制其基因和蛋白质的表达，合理设计的siRNA 作为一种重要的研究工具，可用于基因功能和许多疾病的研究治疗［6，7］。本实验分别针对C2C12 细胞和H9c2 细胞设计合成了不同的CAV3 siRNA，并采用不同的方法尝试提高转染效率，通过带有FAM 绿色荧光修饰的NC siRNA 观察转染情况。Western blot 检测CAV3 蛋白，结果表明设计合成的siRNA 能有效抑制CAV3 蛋白的表达，且在C2C12 细胞中先转染siRNA-2 后分化对CAV3 蛋白的抑制效率最高。

有研究表明，机体在血糖正常时，IMGU 大多发生在肌肉组织，NIMGU 大多发生在非肌肉组织，主要是中枢神经系统，而在高血糖时，通过NIMGU 途径进入肌肉的葡萄糖可高达一半，通过注入生长抑素引起胰岛素严重缺乏的大鼠中，骨骼肌、心肌的葡萄糖摄取只降低了30%～60%，提示在这些组织中 存 在NIMGU 的 代 偿 性 葡 萄 糖 摄 取［8，9］。在 禁 食的低血糖状态下，约75%～83%的葡萄糖摄取通过NIMGU 的机制发生［10］。NIMGU 时可激活AMPK（AMP-activated protein kinase）促使GLUT4 转移到胞膜上，调节葡萄糖代谢［11］［12］，这是由运动、缺氧等因素导致GLUT4 转运至质膜的主要机制［13］。这些研究提示影响机体糖代谢的途径除了IMGU，NIMGU 的作用也不容忽视。

葡萄糖转运是细胞吸收利用葡萄糖的限速步骤，GLUT4 是肌肉收缩或胰岛素刺激的葡萄糖摄取所必需的，胰岛素敏感的GLUT4 在胰岛素刺激或肌肉收缩下易位至肌膜促进葡萄糖的摄取［14］。胰岛素信号转导过程主要涉及的胰岛素受体（Insulin receptor，IR）和GLUT4 均定位于微囊上［15］。在胰岛素抵抗的病理状态下，NIMGU 随着胰岛素敏感性下降而升高，以补偿在IMGU 受损期间有足够的葡萄糖摄取到细胞中［16］。研究提示肌细胞缺失CAV3 导 致 胰 岛 素 反 应 性 和 葡 萄 糖 摄 取 减 少［17，18］。小鼠敲除CAV3 导致胰岛素抵抗的发展，葡萄糖耐量降低，胰岛素刺激的全身葡萄糖摄取减少了20%［19，20］。我 们 前 期 研 究 发 现CAV3 突 变 蛋 白与骨骼肌及心肌疾病相关［21］，可导致C2C12 细胞 葡 萄 糖 代 谢 受 损［22，23］，无 胰 岛 素 刺 激 时，转基因使C2C12 细胞CAV3 蛋白表达增加，促进了葡萄糖的摄取和利用［4］。

本研究显示，在有胰岛素或者无胰岛素存在下，CAV3 蛋白表达下降明显降低骨骼肌细胞的葡萄糖摄取和GLUT4 蛋白表达，表明CAV3 通过GLUT4 参与了骨骼肌细胞的IMGU 和NIMGU，且通过比较可以发现，CAV3 对IMGU 影响更大，但对NIMGU 的影响也不可忽视。在心肌细胞，在有胰岛素或者无胰岛素存在下，CAV3 蛋白表达下降均能明显降低心肌细胞的葡萄糖摄取，表明CAV3 通过GLUT4 也参与了心肌细胞的IMGU 和NIMGU。在本研究中，无胰岛素时，CAV3 蛋白表达下降能下调GLUT4 的表达；在有胰岛素时，（已知胰岛素可刺激GLUT4 的表达）CAV3 蛋白表达下降下调GLUT4 蛋白的效应不太明显，说明在胰岛素介导CAV3 的途径外，还存在一部分两者互相独立的调节GLUT4 机制，相互抵消。但是葡萄糖的摄取明显下降，可能通过抑制GLUT4 向肌膜的易位而影响葡萄糖的摄取，但并没有对蛋白总量造成太大影响。

综上所述，本研究通过建立针对C2C12 细胞和H9c2 细胞的CAV3 si RNA 和转染方法，使CAV3蛋白表达降低，证明在有胰岛素和无胰岛素刺激的不同生存条件下，CAV3 通过GLUT4 介导心肌和骨骼肌细胞IMGU 和NIMGU。本文拓展了在不同生存条件下肌细胞糖代谢的理解，为CAV3 防治糖代谢相关疾病提供了新的参考依据。

作者贡献度说明：

周彩霞、吕倩：负责实验实施，数据处理和论文撰写；卜晓阳、田一夫：负责数据分析；冼晶，黄媛恒，杨立会：负责文献检索和论文修改；黄勤：负责实验设计，实验指导及论文修改指正。

所有作者声明不存在利益冲突关系。