葛根素对实验性大鼠牙周炎炎症反应和骨吸收的影响

万 妮，莫礼文，詹 乐，陈荟颖，张 黎

（海南医学院口腔医学院，海南 海口 571101）

牙周炎作为世界上位居前列的口腔常见疾病，经过研究得出其相关联的系统性疾病至少有50 多种［1］。Bernabe 等人报告说，2017 年全球有7.96 亿例重度牙周炎［2］。在我国大陆有近90%的中国成年人患有不同严重程度的牙周病［3］。

越来越多的证据表明，牙周疾病的发生和发展机制是由宿主对牙周生物膜微生物反应的结果。牙周病原体还释放有害的副产物和酶，分解细胞外基质成分，如胶原蛋白和宿主细胞膜。一旦启动宿主反应，白细胞、成纤维细胞或其他宿主组织衍生细胞释放出各种炎症分子，如细胞因子和前列腺素，引起牙周支持组织的破坏［4］。大量的细胞因子在牙周炎的发病机制中起着关键作用，导致牙周附着丧失和骨吸收。当牙周病原体侵入局部病变时，宿主免疫系统被激活［5］。各种类型的免疫细胞、炎症细胞因子和其他元素参与这一过程，从而导致有效地根除致病菌。对牙周炎发病机制的研究现在被认为属于“骨免疫学”的范畴，骨免疫不仅是造成牙周炎中牙槽骨平衡失调的原因，而且也是调节牙周炎最有效的系统［6］。

葛根作为天然植物，在中医中应用于发烧、腹泻、心血管疾病和糖尿病的治疗已有数千年的历史［7］。葛根素（C21H20O9），由于其丰富的生物活性和药理安全性，近来被用于大量的药理研究［8］。葛根素具有具有强大的抗炎、抗癌和抗氧化活性［9］，可调节炎症级联反应，可能成为治疗牙周炎安全有效的候选药物［10］。

本研究旨在确定葛根素是否能抑制结扎诱导的大鼠牙周炎的牙周支持组织破坏，抑制牙周炎症和牙槽骨吸收。对宿主免疫反应网络中部分细胞因子的调控作用及对牙周炎组织破坏的保护作用，从而说明葛根素是牙周炎治疗的一种有前景的抗炎候选药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 购买7 周龄Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠［（长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0014）］，体重（220±20）g，聚丙烯合成塑料大鼠笼分笼饲养，每4 只一笼，室温（24±2）℃，湿度40%～60%，明暗周期12 h/12 h。可自由获得食物和水。所有进行的动物实验的操作，均根据国际动物伦理的规定进行。

1.1.2 主要试剂及仪器 LPS（Sigma，美国）；葛根素（山东方明药业集团股份有限公司生产，生产批号：20060472）；IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γElisa 试剂盒（凡科维，上海）；多功能酶标仪（Rayto RT-6100，广东）；洗板机（BIOTEK Epoch2，美国）；Micro-CT 成像系统（AX2000-CT，中国奥影）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 基于随机数字表分组，36只大鼠分3 组（n=12）：对照组（CON），牙周炎组（L），葛根素组（PR，400 mg/kg）。牙周炎组和葛根素组用于慢性牙周炎模型的建立，10%水合氯醛腹腔麻醉，用持针器将2.0 mm 结扎丝牢固结扎于左上第一磨牙（M1）近中牙颈部，结扎丝尽量放入牙颈部。所有大鼠的结扎由同一个人完成。一周后，在大鼠M1 颊腭侧正中自龈沟注射20 g/L 的LPS 各25 μL，间隔48 h 注射一次，一共4 次。对照组则同时在同部位提供等量生理盐水。4 d 一次检查钢丝，看钢丝有无松动，如若钢丝滑脱，重新结扎钢丝。建模成功后，大鼠给药14 d，均灌胃给药：CON 组及L 组，提供等量生理盐水；葛根素组（PR），400 mg/kg 葛根素处理。

1.2.2 标本采集 最后一次给药后24 h 麻醉大鼠，腹主动脉取血5 mL，以3 000 rpm 的转速离心血清10 min 后取上清液，冻存于-20 ℃；再处死所有大鼠，部分大鼠分离左侧上颌骨，取M1 颊腭侧实验处新鲜牙龈组织，冻存于-80 ℃，余下上颌骨组织固定于4%多聚甲醛中；部分大鼠左侧上颌骨标本取材后保留牙龈组织，固定于4%多聚甲醛中。

1.2.3 HE 染色 将标本固定于4%多聚甲醛中2 d，用10% EDTA 溶液脱钙8 周，石蜡包埋。每个样本沿近远中方向被切成5 μm 的切片。用苏木精和伊红（HE）对包含左上第一磨牙及远中邻间区的连续切片进行染色。

1.2.4 ELISA 检测 根据说明书要求开展检测，使用ELISA 试剂盒检测血清中细胞因子（IL-4、IL-10、IL-6、IFN-γ）的表达浓度。

1.2.5 Micro-CT 分析 使用Micro-CT 成像系统（AX2000-CT 中国奥影）扫描上颌左侧的固定标本。Micro-CT 的测量条件为：电压90 kV，电流80 μA，图像像素大小3 072×3 072；层厚为4 μm。扫描后，使用Vgstudio MAX3.5 版本软件进行分析，平行于M1 颊、腭面牙根长轴测量釉牙骨质界（CEJ）到牙槽嵴顶（ABC）的距离。每颗牙齿6 个测量值，其平均值被定义为每只大鼠的附着丧失距离（AL）［11］。测量M1 根间区域的骨表面积/总体积（BV/TV）。

1.3 统计学处理

使用GraphPad Prism 9.4.1 进行数据的分析处理，各组之间的比较使用t检验和方差分析。显著性差异为P＜0.05。

2 结果

2.1 组织学分析葛根素对炎症浸润的影响

组织学观察在L 组的M1 根分叉及远中邻间隙区域观察到明显的炎性浸润和牙槽骨损失（图1B）。与L 组相比，PR 组（图1C）的炎性浸润明显减少，牙槽骨损失显著降低。

图1 左上第一磨牙根分叉及远中邻间区的炎症细胞浸润和骨吸收区（HE，100×，100 μm）Fig 1 Inflammatory cell infiltration and bone resorption areas in the root bifurcation and distal-middle inter-adjacent area of the left upper first molar（HE，100×，100 μm）

2.2 ELISA 分析葛根素对外周血中IL-4、IL-10、IL-6、IFN-γ 表达的影响

血清ELISA 检测结果显示：对比CON 组和L组中的IL-4 和IL-10，L 组浓 度降低，IL-6 和IFN-γ浓度则上升；经葛根素治疗后，IL-4、IL-10、IL-6、IFN-γ 表达量则相反，均逐渐接近CON 组，浓度差异均显著（P均＜0.05）（图2）。

图2 ELISA 观察大鼠血清中炎症细胞因子表达情况Fig 2 ELISA observation of inflammatory cytokine expression in rat serum

2.3 Micro-CT 分析葛根素对骨吸收的影响

大鼠左侧上颌骨三维重建图像结果（图3 A～C）显示：L 组在M1 周围出现明显且不规则的骨吸收。PR 组牙槽骨吸收较L 组有所减缓。AL 测量结果（图3D）显示：与CON 组相比，L 组和PR 组均显示CEJABC 距离的增大，且距离差异显著（P＜0.05）；相较L组，PR 组CEJ-ABC 距离有所降低（P＜0.05）。对3组大鼠进行BV/TV 定量分析（图3E）：与CON 组或PR 组相比，L 组的BV/TV 比率显著降低。葛根素显著减少了骨丧失的体积（P＜0.05）。

图3 Micro-CT 观察左侧上颌第一磨牙牙槽骨吸收的情况（A-C），左侧上颌第一磨牙附着丧失距离（mm）（D），左侧上颌第一磨牙感兴趣区骨体积分数（%）（E）Fig 3 Micro-CT observation of alveolar bone resorption of the left maxillary first molar（A-C），loss of attachment distance of the left maxillary first molar （mm）（D），bone volume fraction （%）in the area of interest of the left maxillary first molar（E）

3 讨论

炎症和牙槽骨吸收是牙周炎的标志症状。牙周病的治疗侧重于通过机械清创术减少牙周袋中的细菌负荷，但调节宿主免疫炎症反应可能在阻止疾病进展和促进愈合和修复方面发挥重要作用［12］。可以抑制骨吸收的新型药物的开发不仅提供了针对软组织炎症的机会，而且也提供了针对牙周炎中观察到的破坏性骨吸收的机会。抑制炎性细胞募集和促炎性介质的产生被认为是牙周炎治疗中的重要靶点。近来，葛根素被证明可以调节宿主反应，其低毒性引起了人们的广泛关注，具有许多文献证明的抗炎和抗破骨作用［13］。因此，本研究旨在确定葛根素是否能够在结扎诱导的实验模型中抑制炎症和骨丧失，保护牙周组织。

牙周炎的发病机制不可避免地与炎症细胞因子级联以及免疫细胞与牙周细胞之间的串扰有关［4］。牙周病原体诱导的宿主免疫反应和细胞因子的过度表达对加重牙龈炎症和激活骨破坏产生了深远影响。牙周炎中涉及的细胞因子及其相关细胞形成了一个针对细菌的复杂且完整的宿主免疫反应网络，包含公认的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，密切相关的Th 细胞亚群（Th1、Th2、Th17 和Tregs），这些细胞最具代表性的细胞因子分别为IFN-γ、IL-4、IL-17 和IL-10［14］，在骨免疫系统中这些细胞因子对调节骨骼健康也起着重要作用［15］。IL-4对牙周炎具有保护作用，对破骨细胞有直接和间接作用［16］。IL-10 是一种强大的抗炎和免疫抑制因子，是Treg 反应的重要生物标志物，减缓牙周疾病的进展并抑制牙周炎症［17］。IL-6 已被证明为慢性炎症的主要参与者，并被证明在许多细胞中具有多种功能，是由病原体相关分子模式、刺激和促炎细胞因子诱导的炎症放大器，并且IL-6 对适应性免疫反应也具有促炎作用［14］。IFN-γ 可以增强体外破骨细胞生成，并在体内加重牙龈炎症和牙槽骨丢失［18］。因此，我们从这些细胞因子的角度来探讨葛根素的抗炎及骨保护作用。

为了证实葛根素在实验性牙周炎中的抗炎作用，通过HE 染色对牙周组织行组织学观察，其结果表明与牙周炎组相比，葛根素治疗后炎症细胞浸润减少。对血清中的炎症细胞因子也观察到类似的结果，L 组中异常的炎性细胞因子（IL-4、IL-10、IL-6和IFN-γ）表达，经葛根素治疗后，在PR 组中被逆转。Wang 等［19］的研究显示在败血症小鼠模型中，葛根 素可抑制炎症因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的转录，增加血清IL-10 水平，减少败血症小鼠的全身炎症并保护器官损伤。Liang 等［20］的实验表明葛根素减轻先兆子痫的症状，并在体外和体内抑制炎症和细胞凋亡，对异常的胎盘炎性细胞因子（TNF、IL-6、IFN-γ）表达降低，IL-4 表达升高。与这些研究结果相一致，本研究中葛根素对大鼠模型牙周炎组织损伤也起到保护作用，减少了浸润的炎性细胞，并使血清中的炎症细胞因子浓度逆转，逐渐趋于正常值。这些数据表明，葛根素可能在抗炎作用中发挥重要作用。

接着，本课题组研究了葛根素对牙槽骨吸收的影响。通过Micro-CT 三维重建显示，PR 组的牙槽骨吸收比L 组少，BV/TV 比更高。这与HE 染色中观察到的PR 组牙槽骨吸收情况一致。这表明葛根素对牙槽骨吸收具有抑制作用，与以往对葛根素在骨保护方面的活性研究［9］是一致的，如葛根素在小鼠颅骨骨溶解模型中可减弱破骨细胞生成、骨溶解［21］，一项Meta 分析结果显示葛根素对OVX 诱导的绝经后骨质疏松小鼠模型的骨量有上调作用［22］。

宿主免疫反应网络中的相关细胞因子过量释放，导致炎症反应的放大，炎症反应的恶化随着组织的破坏而发展，导致结缔组织的破坏。这些细胞因子可直接或间接激活骨膜成骨细胞，改变成核因子κB 配体受体激活剂的蛋白的表达水平，触发破骨细胞活性，从而引起牙槽骨的吸收［23］。葛根素抑制牙周炎炎症和牙槽骨吸收其部分原因可能是其对IL-4 和IL-10 的促进作用及对IL-6 和IFN-γ 的 抑制作用，通过调节炎症级联反应，改善牙龈炎症和牙槽骨破坏，有助于牙周炎的治疗和恢复。

综上，研究证据表明，葛根素可以通过增加IL-4 和IL-10、降低IL-6 和IFN-γ 来缓解结扎诱导的实验性牙周炎大鼠的牙龈炎症反应和牙槽骨吸收，保护牙周支持组织。然而，为了更好地了解葛根素在牙周病中的作用，以及确定葛根素是否可以直接作用于结扎诱导的实验性牙周炎中的破骨细胞，进一步阐明葛根素在牙周炎中抗炎和抑制牙槽骨丧失的机制，还需要进行更多的研究。

作者贡献度说明：

万妮：进行实验设计，实验实施，成文；张黎进行实验设计，审校；莫礼文：实验实施，资料收集；詹乐、陈荟颖：资料收集。

所有作者声明不存在利益冲突关系。