基于网络药理学与数据挖掘探讨中药调节坏死性凋亡的用药规律

郭家敏，郭宵飞，孙诗艺，李静静，邓晓曦，张 平

（中国中医科学院望京医院，北京 100102）

坏死性凋亡（necroptosis）又被称为程序性坏死，当发生细胞凋亡的条件缺少时，受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）及其下游的受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和混合谱系激酶域样蛋白（MLKL）将会激活坏死性凋亡的通路［1，2］。它不依赖于半胱氨酸天冬氨酸酶（Caspase）活性，当caspase-8 依赖的凋亡通路被阻断时，肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、TOLL 样受体（TLR）等的刺激作用可激活RIPK1，募集RIPK3 并发生磷酸化，活化的RIPK3调控MLKL 诱导其寡聚化，易位至质膜内叶破坏细胞膜的完整性，因此细胞表达RIPK3 以及caspase-8分子受到抑制是坏死性凋亡发生的必备条件［3-6］。

坏死性凋亡存在于肿瘤、自身免疫病等多种疾病的发生过程中，而研究坏死性凋亡干预制剂也逐渐成为新的研究热点［7，8］。已有研究表明逍遥散、大黄蛰虫丸等中药复方通过调节坏死性凋亡治疗疾病［9-11］，然而中药在坏死性凋亡领域的研究仍较少，暂未系统地总结出中药用药规律，因此本研究利用网络药理学技术筛选坏死性凋亡相关靶点对应的小分子化合物，通过化合物的桥接作用筛选相关中药并挖掘其性味归经信息，总结中药使用规律，为坏死性凋亡干预制剂的研发提供一定的参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 获取坏死性凋亡相关靶点

借 助GeneCards （http：//www.genecards.org）［12］、DrugBank （http：//go.drugbank.com/）［13］、TTD（https：//bidd.nus.edu.sg）［14］、DisGeNET （www.disgenet.org）［15］、OMIM （https：//omim.org）［16］数 据库，以“necroptosis”为关键词进行检索，获得坏死性凋亡相关靶点，利用UniProt （https：//www.uniprot.org）［17］数据库查寻靶点全称。

1.2 筛选候选化合物并构建靶点-化合物网络

通过中药系统药理学数据库（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）筛选与坏死性凋亡靶点相关的化合物。候选化合物应满足ADME 标 准 及Lipinski 规 则［18］：口 服 生 物 利 用 度≥30%，类药性［19］≥0.18，半衰期≥4，可旋转键数［20］≤10，拓扑极性表面积［21］＜140，分子量≤500 Da。将收集到的靶点、候选化合物导入Cytoscape3.9.1 软件构建靶点-化合物网络。

1.3 获取中药及性味归经信息并构建靶点-化合物-中药网络

使用TCMSP 数据库检索与候选化合物相关的中草药，合并去重后规范中药名称并匹配性味归经信 息，将《中 华 人 民 共 和 国 药 典》［22］、《中 药 学》［23］、《中华本草》［24］中无法查找到相关信息的中药予以删除。将化合物-中药信息与“1.2”项得到的靶点-化合物信息一同导入Cytoscape3.9.1 软件构建靶点-化合物-中药相互关系网络，利用Cytoscape3.9.1软件中Analyze Network 模块功能分析该网络节点的拓扑学属性值［25，26］。为了更加直观地展示坏死性凋亡及其对应靶点、化合物、中药之间的关系，本研究选取度值≥6 的中药及其对应靶点、化合物进一步构建核心靶点-化合物-中药相互关系网络，评估中药及化合物干预坏死性凋亡的功效强度［27］。

1.4 主要靶点-化合物分子对接

分子对接能够判断靶点与候选化合物作用关系的可信度，因此选取核心网络中度值排名前5 的靶点（度值≥8）与度值排名前8 的化合物（度值≥10）进行分子对接，判断核心网络中靶点与化合物作用关系强度［28］。靶点蛋白的晶体结构文件利用PDB 数据库进行下载并使用PyMOL 软件去除晶体结构中的水分子，通过AutoDockTools-1.5.7 软件（ADT）加全氢并设置为受体导出pdbqt 格式［29］。候选化合物的MOL2 结构从TCMSP 数据库进行下载，通过ADT 软件加全氢设置为配体导出pdbqt 格式。运用ADT 插件Autodock4 进行分子对接并使用PyMOL 软件对其结果进行可视化。

2 结果

2.1 坏死性凋亡相关靶点

分别从GeneCards、OMIM 数据库获得636、19个坏死性凋亡相关靶点，其他数据库未检索出相关靶点。GeneCards 数据库可根据布尔模型（Boolean）计算相关性值得出各靶点的Score 评分，Score评分越高表示该靶点与坏死性凋亡的相关程度越高。因此筛选出GeneCards 数据库中Score 值前10%的靶点作为坏死性凋亡相关靶点，与OMIM 数据库所得19 个靶点合并后去除重复值，一共得到79个靶点，其中有21 个靶点能够匹配到小分子化合物，所匹配的小分子化合物能够满足ADME 及Lipinski 规则的靶点12 个，因此这12 个靶点可看作是与坏死性凋亡相关的潜在靶点，见表1。

表1 坏死性凋亡潜在靶点基本信息Tab 1 Basic information on potential targets of necroptosis

2.2 候选化合物结果及靶点-化合物网络的构建

以各靶点的蛋白名称作为检索词，检索TCMSP 数据库共得到与潜在靶点相关的化合物517个，其中满足ADME 标准及Lipinski 规则的候选化合物191 个，根据检索结果构建靶点-化合物网络，见图1。该网络由204 个节点和351 条边组成，图中蓝色六边形表示候选化合物，粉色菱形表示潜在靶点，节点度值越高所示图形越大，表示该靶点在网络中的作用越关键。网络中度值前5 的靶点为GSK3B、MAPK14、BCL2、TNF、TP53，分 别 对 应162、122、16、15、12 个化合物；度值排名靠前的化合物主要有槲皮素（quercetin）、汉黄芩素（wogonin）、雷公藤内酯醇（triptolide）、甘草查尔酮（licochalcone a）、玫瑰树碱（ellipticine）分别与7、5、4、4、3 个靶点相关。

图1 坏死性凋亡靶点-化合物网络Fig 1 Necroptosis apoptosis target-compound network

2.3 筛选中药并构建靶点-化合物-中药作用关系网络

利用TCMSP 数据库检索出389 味与候选化合物相关的中药，其中可匹配到性味归经者366 味，通过化合物的联接作用构建靶点-化合物-中药作用关系网络，该网络由569 个节点以及1 397 条边组成。其中度值排名前10 味的中药分别是甘草、丹参、苦参、半枝莲、桑叶、葛花、鸡血藤、降香、菊花、山豆根，分别对应48、10、10、10、10、9、9、9、9、9 个化合物，见图2。利用化合物的联接性统计中药相关联的靶点数目，连翘可作用11 个靶点，甘草、银杏叶、败酱草、半边莲等均可作用10 个靶点，见图3。由于化合物度值的中位数是3，因此将网络中度值＞6 的化合物视为核心化合物，其中度值居前5 位的化合物分别为β-谷甾醇、槲皮素、山奈酚、木犀草素、异鼠李素，见表2。为展示调节坏死性凋亡的核心中药及相关靶点、化合物，从上述网络中筛选出度值≥6的中药及其对应的化合物、靶点构建核心靶点-化合物-中药网络。该网络包含177 个节点、546 条边，其中黄色箭头表示靶点、粉色六边形表示化合物、绿色菱形表示中药，度值越高节点形状越大，见图4。对366 味中药性味归经进行统计，结果显示调节坏死性凋亡的中药多为寒性、温性，味多苦、辛，多归肝经、肺经，见图5。

表2 中药干预坏死性凋亡潜在核心化合物（度值＞6）Tab 2 Potential core compounds of traditional Chinese medicine intervention in necroptosis（degree value＞6）

图3 中药靶点数（前20 位）Fig 3 Number of traditional Chinese medicine target points （Top 20）

图4 核心靶点-化合物-中药网络Fig 4 Core target-compound-traditional Chinese medicine network

图5 中药性味归经统计图Fig 5 Statistical chart of the meridian distribution of traditional Chinese medicine

2.4 分子对接结果

将核心靶点-化合物-中药网络中高度值（≥8）靶点GSK3B（PDB ID：5K5N）、MAPK14（PDB ID：1WBS）、BCL2（PDBID：2W3L）、TNF（PDB ID：2AZ5）、TP53（PDB ID：5O1H）与高度值（≥10）化合物进行分子对接。根据结合能与氢键数综合评估分子对接的结果，其中结合能＜-5.0 kcal/mol 的靶点与化合物对接活性良好，结合能＜-7.0 kcal/mol 则表示对接活性强烈，形成氢键数越多的靶点与化合物对接质量越好［29］。结果显示，对接结合能最高的为TP53-kaempferol（-9.89 kcal/mol），结合能最低的为BCL2-quercetin（-4.75 kcal/mol），40组对接结果平均结合能为-6.80 kal/mol；对接氢键数最多为8 个，最少者没有对接氢键，平均氢键个数为4，提示所选核心靶点与化合物结合活性较强，对接质量较好，见图6、7。综合考虑分子对接结合能和氢键个数，选择对接情况较好的4 个组合进行三维结构展示，见图8。

图7 核心靶点-化合物分子对接氢键数热图Fig 7 Thermal diagram of hydrogen bond numbers of core target-compound molecular docking

图8 调节坏死性凋亡核心靶点与化合物分子对接结构图Fig 8 Structural diagram of the docking between the core target of regulating necroptosis and compound molecules

3 讨论

作为细胞程序性死亡的一种方式，坏死性凋亡在多种疾病的病理过程发挥着双重作用，一方面坏死性凋亡发生时释放的胞内物质能够参与固有免疫反应，另一方面其释放的炎性物质又会加剧炎症反应［30］。因此单一的坏死性凋亡干预制剂无法解决其复杂的发病机理，而具有多种成分、靶点的中药逐渐变成新药研发的重要来源。

研究结果显示，高度值靶点有GSK3B、MAPK14、BCL2、TNF、TP53 等。其中GSK3B 基因编码的蛋白GSK3β 失活可使RIPK1 抑制剂受到抑制，从而诱导坏死性凋亡［31］。BCL2 在细胞凋亡的调控中具有重要作用，BCL2 家族蛋白协调线粒体外膜（MOM）的透化，MOM 透化（MOMP）导致促凋亡分子的激活，而BCL2 蛋白家族调节坏死性凋亡的具体作用机制目前尚不清楚［32］。TNF 是一种炎症相关细胞因子，MAPK14 及其底物MAPKAPK2（MK2）在TNF 诱导的炎症细胞因子产生中发挥重要作用，RIP3 是TNF 引起的坏死性凋亡的关键调节因子，RIP3 表达缺失可能会降低细胞对坏死性凋亡刺激的敏感性，从而促进细胞存活和肿瘤发生［33］。TP53 基因属一种肿瘤抑制基因，它在活性氧（ROS）诱导的坏死性凋亡中起作用，它在线粒体基质中积累并与亲环蛋白-D（CypD）形成复合物，这是ROS 产生并导致线粒体PTP 开放进而诱导线粒体肿胀和坏死性凋亡所必需的［34，35］。

根据筛选结果，化合物度值较高的有槲皮素、汉黄芩素、雷公藤甲素、甘草查尔酮A 等，这些化合物与靶点连接较多，被认为是干预坏死性凋亡的主要活性成分。槲皮素属于黄酮醇类化合物，它具有多种生物学特性，能够通过抑制大鼠脊髓损伤后M1 巨噬细胞/小胶质细胞极化来减轻少突胶质细胞的坏死性凋亡［36］。坏死性凋亡是急性肾损伤发病机制中的一个关键事件，而汉黄芩素被证明可以通过靶向RIPK1 介导的坏死性凋亡来抑制急性肾损伤中的炎症反应和肾小管细胞死亡［37］。RIPK1-RIPK3-MLKL 信号通路已被广泛认为是坏死性凋亡的主要介导通路，研究发现雷公藤内酯醇可通过该通路诱导肝癌细胞发生坏死性凋亡从而发挥抗癌作用［38］。TLR 在坏死性凋亡的发生过程中有着重要作用，研究显示甘草查尔酮 A 以剂量依赖 性 方 式 抑 制TLR4 表 达，MAPK 和NF-κB 活 化，而TLR4 的过表达能够部分消除甘草查尔酮 A 对脂多糖（LPS）诱导的炎症和TLR4 信号激活的抑制作用［39］。

中药方面，甘草、连翘、银杏叶、杜仲等可干预坏死性凋亡的靶点较多，是调节坏死性凋亡的重要中药。研究发现甘草主要成分异甘草素、连翘主要成分连翘苷均可通过抑制NF-κB 信号通路发挥抗炎作用，而NF-κB 信号通路是坏死性凋亡诱发炎症反应的常见机制，因此推测甘草、连翘均可抑制坏死性凋亡所致的炎症反应［40-42］。动物实验显示，银杏叶提取物761（EGb761）可以通过减弱RIP1 介导的线粒体功能障碍抑制细胞坏死性凋亡，因此推测该途径可能为银杏叶调节坏死性凋亡的机制；杜仲主要成分杜仲苷则可通过抑制坏死蛋白MLKL 和RIP1 进而抑制坏死性凋亡发挥对癫痫持续状态大鼠的神经保护作用［43，44］。分子对接结果显示，多数化合物与靶点之间对接活性良好，其中化合物luteolin 与isorhamnetin 表现突出。luteolin、isorhamnetin均可通过抑制NF-κB 通路控制炎症，这与坏死性凋亡诱导炎症通路相类似，推测luteolin、isorhamnetin可通过该途径调节坏死性凋亡［45，46］。

中药性味归经统计结果表明，调节坏死性凋亡潜在中药多苦寒、辛温，苦味“能泻，能燥，能坚”，多有燥湿泻热的功效；《内经》云“治热以寒”“热者寒之”，寒性药多可清热泻火，因此苦寒药用于治疗湿热互结证。辛味药多有调达气机、通行血脉的功效；温性药可温里散寒，辛温药临床多用于治疗表证。潜在中药多归肝、肺二经，《素问》曰：“肝生于左，肺藏于右”“肝者，将军之官，谋虑出焉”“肺者，相傅之官，治节出焉”，肝脏以升发为宜，肺脏以肃降为顺，二者一升一降共同调理全身气机。现代研究也显示坏死性凋亡的终末效应物MLKL 的缺失可减少小鼠肝损伤以及肝脏纤维化，这表明坏死性凋亡常造成不同程度的肝损伤，故调节坏死性凋亡的潜在中药多归属肝经［47］。综上推测，坏死性凋亡中医病机多为肝郁化火，木火刑金；病性多属热证、表证、实证；病位多在肝，与肺密切相关；治疗上以清热泻火、解表散邪为治则。

本研究运用网络药理学的方法结合数据挖掘初步探讨了中药调节坏死性凋亡的物质基础及用药规律，为从中医层面解读坏死性凋亡等细胞程序性死亡的机制提供思路，为中西医结合治疗坏死性凋亡相关疾病提供借鉴。由于网络药理学是基于数据库的定量分析，因此本研究仅从理论层面阐述了坏死性凋亡相关靶点、化合物、中药之间的关系，存在一定的局限性，结果有待更深入的实验性研究予以证实。

作者贡献度说明：

郭家敏、郭宵飞、李静静、邓晓曦：论文选题与研究设计；孙诗艺：数据的核验与统计；郭家敏：数据分析，论文起草；郭宵飞、孙诗艺：论文修订；张平：对论文的指导与审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。