三黄漱口液通过调节TLR4-NF-κB通路减轻大鼠牙周炎症状

徐俊峰,徐婉君,董艳蓉,邓祖跃,蒋 霞,袁 颖,方建红,万 悦,任艳云

(1.浙江省立同德医院口腔科,杭州 310012; 2.浙江省食品药品检验研究院,杭州 310052; 3.中国人民解放军联勤保障部队第903医院口腔科,杭州 310013)

牙周炎是一种由口腔局部因素引起牙周支持组织的慢性炎症,主要表现为牙龈红肿出血和牙槽骨吸收,严重时致使牙齿松动、脱落,影响口腔机能[1]。有研究[2]表明,Toll样受体4(TLR4)参与牙周炎的发生和发展过程,口腔内微生物可激活TLR信号通路,强化炎症反应。TLR4不仅存在于树突细胞、单核巨噬细胞、B淋巴细胞等免疫细胞表面,上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等非免疫细胞也表达TLR4[2]。TLR4的N端结构识别脂多糖(LPS)等病原相关模式分子(PAMP)后,其构象发生变化,进而激活细胞内下游信号通路,最终主要作用是核因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化[3]。NF-κB能调节肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-10(IL-10)等炎症因子的表达[4]。因为NF-κB通路与炎症反应和破骨过程的联系十分紧密,阻断NF-κB通路可能有助于牙周炎的防止,而抑制TLR4的表达更能有效抑制TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的上调[5-6]。

三黄漱口液主要成分为黄连、黄芩、黄柏、甘草、金银花、茜草、乌梅、麦冬和菊花。君药三黄,即黄芩、黄连和黄柏经常联用,黄芩偏重于上焦湿热,黄连偏重于心火、胃火等中焦,黄柏偏重于下焦湿热,三药连用可泻火解毒[7]。臣药茜草可滋阴凉血;金银花、菊花清热解毒;乌梅、麦冬生津;甘草调和诸药。上药配合,共成清热解毒、凉血化瘀止血,生津之剂,对牙周炎的临床治疗效果显著,能有效减轻疼痛和牙周出血,同时也能达到局部杀菌消炎,清洁口腔的目的,具有良好的临床应用价值。

本研究旨在探究三黄漱口液治疗牙周炎的功效是否与TLR4-NF-κB通路有关,分析该药的药理作用机制,为其临床应用提供实验数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器

主要试剂:大鼠白介素-8(IL-8)ELISA试剂盒(ELS-2803-2)和大鼠白介素-10(IL-10)ELISA试剂盒(ELS-2871-2)购自合肥博美生物科技有限责任公司; NF-κB抗体(sc-8008)和TLR4抗体(sc-293072)购自美国Santa Curz公司;GAPDH抗体(AF1186)和Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)购自上海碧云天生物技术有限公司;Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP(BS13278,购自美国Bioworld公司);制备三黄漱口液所需的中药饮片由浙江省立同德医院药剂科提供。

三黄漱口液的制备:取中药饮片黄连2 g、黄柏5 g、金银花5 g、茜草5 g、乌梅5 g、黄芩5 g、菊花5 g、麦冬8 g、甘草3 g,第一道加入1000 mL水,浸泡30 min后,煮沸30 min,第二道加入200 mL水,煮沸30 min,合并2道汤剂,过滤后浓缩至生药浓度为1.12 g·mL-1的药液备用。

主要仪器:Spectra Max190酶标仪(美国Molecular Devices公司);AI6000化学发光成像系统(美国GE公司);RM2400型切片机和生物显微镜(德国Leica公司);ViiA 7实时定量PCR仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠,体重180～200 g,清洁级,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养条件:光照12 h·d-1(时间为8∶00～20∶00),自由饮食饮水,温度20～22 ℃,相对湿度为75%。实验开始前,进行为期1周的适应性饲养。

1.3 大鼠牙周炎模型的建立

在已有的牙周炎模型建立方法[8]基础上进行改良。先用2%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠(腹腔注射,0.3 mL·100 g-1),固定好大鼠头部和躯干后,在上颌左第二和第三磨牙之间插入1个3-0的丝线结扎,结扎第二磨牙,两端打结固定,同时将大鼠饮用水更换为10%蔗糖水溶液。每天检查结扎物,以确保它们在实验期间保持在适当的位置,如有脱落及时进行重新结扎。4周后,可见模型大鼠出现牙龈红肿出血、牙槽骨吸收及牙齿松动现象。

1.4 动物分组与给药

将60只大鼠随机分成对照组、模型组、三黄漱口液低剂量组、三黄漱口液中剂量组、三黄漱口液高剂量组和甲硝唑组,每组10只。除了对照组,其余5组同时进行牙周炎模型建立,模型建立成功后开始给药。每天2次口腔黏膜涂布给药,三黄漱口液低剂量、中剂量和高剂量组每天使用的三黄漱口液生药量分别为4.48、8.96和13.44 g·kg-1,甲硝唑组每天使用0.02 g·kg-1甲硝唑,对照组和模型组使用0.9% NaCl溶液,连续给药1个月后处死动物,取上颌组织备用。

1.5 HE染色

大鼠上颌骨标本用冰浴的PBS缓冲液漂洗干净后,置于10%中性甲醛中固定48 h,用乙二酸四乙酸二钠溶液脱钙处理1个月,再进行石蜡切片,切片厚度为5 μm。进行常规苏木精-伊红(HE)染色,在光学显微镜下观察炎性细胞浸润及牙槽骨吸收等牙周组织的病理学形态学变化。

1.6 ELISA检测

切取大鼠牙周炎模型的牙周组织,称重后加入相应体积的PBS缓冲液,使用匀浆仪充分匀浆,离心后收集上清液。按照ELISA试剂盒提供的说明书进行试验,检测各组大鼠牙周组织中促炎因子IL-8和抗炎因子IL-10的水平。

1.7 Western blot检测

切取大鼠牙周炎模型的牙周组织,称重后按10 μL·mg-1加入RIPA裂解液,使用匀浆仪充分匀浆,离心后收集上清,用Bradford蛋白浓度试剂盒测定其蛋白浓度。按体积比4：1加入蛋白上样缓冲液,沸水浴10 min使蛋白变性,制胶进行SDS-PAGE电泳及转膜。用5%脱脂奶粉对聚偏二氟乙烯(PDVF)膜进行封闭处理1 h,4 ℃下进行一抗孵育过夜。用TBST缓冲液洗膜3次后,进行二抗孵育1 h。TBST缓冲液洗膜2次,TBS缓冲液洗膜1次后,进行显色处理。以GAPDH为内参,用Image J软件进行图片分析。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠牙周炎模型

牙周炎模型建立4周后,对照组和其余5组的牙周组织形态明显不同:对照组大鼠牙周组织呈粉红色,质地坚韧,无探诊出血,牙槽骨无吸收(图1A);模型组大鼠牙龈组织呈暗红色,有明显的牙槽骨吸收、牙根分叉、探诊出血和牙周组织松软现象,提示炎症改变( 图1B)。

A:对照组;B:模型组。黑色箭头所示为牙周炎组织。图1 大鼠牙周炎模型

2.2 三黄漱口液改善牙周炎组织病理形态

HE染色结果显示:对照组牙周组织正常,没有炎性细胞浸润(图2A);模型组牙周组织内有大量炎细胞浸润,牙槽骨吸收明显(图2B);与模型组比较,三黄漱口液各剂量组和甲硝唑组的牙周组织中炎性细胞浸润减少,成纤维细胞增生增加,低剂量组改变程度不明显(图2C),中剂量组有明显改变(图2D),高剂量组和甲硝唑组改变最为明显(图2E—F)。

A:对照组;B:模型组;C:三黄漱口液低剂量组;D:三黄漱口液中剂量组;E:三黄漱口液高剂量组;F:甲硝唑组。红色箭头所示为牙周组织中浸润的炎性细胞。

2.3 三黄漱口液降低牙周炎性反应

ELISA实验结果表明,与对照组相比,模型组牙周组织中促炎因子IL-8的水平明显升高,抗炎症因子IL-10水平显著下降(P<0.01)。三黄漱口液各剂量组IL-8水平随用药剂量增加逐渐降低,IL-10水平随用药剂量增加逐渐升高,三黄漱口液高剂量组的IL-8、IL-10水平与甲硝唑组相近。与模型组相比,三黄漱口液中、高剂量组和甲硝唑组的IL-8水平显著降低,IL-10水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 三黄漱口液影响牙周IL-8和IL-10水平

2.4 三黄漱口液影响TLR4-NF-κB通路相关蛋白表达

与对照组相比,模型组的TLR4和NF-κB的表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,三黄漱口液各剂量组的TLR4和NF-κB的表达均降低(P<0.05或P<0.01);与三黄漱口液低剂量组比较,三黄漱口液中剂量组和三黄漱口液高剂量组TLR4和NF-κB的表达进一步降低(P<0.01)。见图3。

*与对照组比较P<0.01;#与模型组比较P<0.05;##与模型组比较P<0.01;△P<0.01与三黄漱口液低剂量组比较。

3 讨论

牙周炎是一种世界性常见疾病,其全球年龄标准化患病率为11.2%[8]。同时,口腔病灶中的微生物及其代谢产物可进入身体其他组织器官,诱发多种疾病,如糖尿病、早产及低体重儿、心血管疾病、风湿性关节炎等[9]。

本次实验结果表明,给予三黄漱口液的牙周炎大鼠牙周组织与模型组相比,形态学发生了明显改变,主要表现为牙周组织的炎性浸润明显减少,成纤维细胞增生活跃,初步验证了三黄漱口液对牙周炎的治疗作用。文献[6]提到,牙周炎是一种由福赛拟杆菌、伴放线聚集杆菌和牙龈卟啉单胞菌等革兰氏阴性厌氧菌感染引起的慢性炎症性疾病,LPS是牙周炎病原菌的重要致病因素。TLR4是模式识别受体家族的关键受体之一,是LPS的主要受体,与牙周炎症的发生发展密切相关[10]。有研究[11]显示,LPS处理过的人牙周膜细胞(human periodontal ligament cell,hPDLC)中TLR4的表达显著上升,且有研究者[12-13]发现牙周炎病人的唾液和血浆中的TLR4表达明显提高。本实验结果表明,牙周炎模型组TLR4的蛋白表达明显升高,与对照组相比一致。TLR4通路的激活可以增强NF-κB的活性,从而促进炎症因子的生成[14-15]。NF-κB是一种公认的转录因子,可以调节炎症细胞因子的产生,包括TNF-α、IL-1、IL-8和IL-10等[16]。同时有研究者报道,TLR4表达的增加与NF-κB的激活相关,以响应TLR4配体,导致促炎细胞因子水平升高[17]。在hPDLC炎症反应实验中,LPS诱导后,miR-146a 通过抑制 TLR4 信号途径抑制炎症反应,并降低炎性细胞因子 NF-κB 的表达[18]。本研究发现,与对照组相比,牙周炎模型组NF-kB蛋白表达明显升高,促炎因子IL-8的水平明显升高,同时抗炎因子IL-10的水平明显降低。三黄漱口液给药后,牙周炎大鼠的牙周组织中TLR4、NF-κB蛋白表达和促炎因子IL-8的水平均降低,而抗炎因子IL-10的水平有所升高,这表明三黄漱口液可能通过调节TLR4-NF-κB通路发挥对牙周炎的治疗作用。

综上所述,本研究结果证明三黄漱口液对牙周炎具有一定的治疗作用,其作用机制可能包括降低TLR4水平,调节TLR4-NF-κB通路,促进抗炎因子IL-10的生成和抑制促炎因子IL-8的生成。