鼠伤寒沙门氏菌荧光定位报告菌株的构建及其在猪肺泡巨噬细胞的示踪应用

肖 红,何 珍,田 棋,黄鑫淼,廖卫东,黄廷华,姚 敏

(长江大学 动物科学学院,湖北 荆州 434020)

随着沙门氏菌病的频发以及给世界养殖业和公众健康带来的损失与危害,对沙门氏菌感染的研究成为社会关注的焦点之一。沙门氏菌通过三型分泌系统(T3SS-2)将蛋白转运到宿主细胞的胞质中,与宿主免疫系统互作,调节其在宿主细胞内的存活和复制[1]。有效地跟踪沙门氏菌在胞内的存活、增殖及与宿主细胞的互作是探索沙门氏菌致病机制的重要方面。

一些报告已使用化学荧光染料标记细菌开展病原菌与宿主细胞的互作及机制研究[2-4]。由于化学物质的非特异性,标记化合物可能从细菌泄漏到细胞,产生非细菌的荧光标记,干扰研究者对细菌在细胞内的行为观察。其次,并非所有细菌都以相同的效率染色,并且细菌生物膜对荧光染料的渗透性差异妨碍了研究者对细菌活力的判断[5]。因此,化学荧光染料标记细菌对于跟踪活宿主细胞内细菌病原体的价值有限。增强型绿色荧光蛋白 (Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)是一种发光的水母蛋白,具有体积小、稳定性强、探测时不需要外源底物等优点。 它广泛应用于生物学研究,包括细胞分化、基因追踪和体内蛋白质定位和操作的研究[6-7]。 GFP能在多种原核生物中表达而发光,包括大肠杆菌、乳酸乳球菌和戈登链球菌[8-10]。EGFP的表达不会改变细菌与宿主细胞的相互作用,并且可以在活的哺乳动物细胞中观察到表达EGFP的细菌[11]。

本研究通过电转法将带有沙门氏菌毒力基因PagC的启动子序列(PpagC)和增强型荧光蛋白基因(EGFP)的质粒转入Sal-14028中,获得能产生荧光信号的Sal-pPpagC-EGFP菌株。比较研究了荧光菌株与野生菌株在生化特征和生长特征等方面的差异。此外,本研究通过细胞侵染试验初步探讨了Sal-pPpagC-EGFP在猪肺泡巨噬细胞中的定位示踪作用,以期为沙门氏菌感染细胞的分子机制研究提供有效的生物材料。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒、细胞株和小鼠

鼠伤寒沙门氏菌14028标准株及其感受态细胞、大肠杆菌DH5α感受态细胞均由长江大学动物科学学院实验室保存。pET28a-EGFP质粒、pMD18-T载体购自TaKaRa公司。猪肺泡巨噬细胞3D4/21由本实验室保存。BALB/c小鼠购自华中农业大学实验动物中心,体质量18～25 g。

1.2 试验试剂

T4DNA连接酶、限制性内切酶、卡那霉素(Kanamycin,Km)购自TaKaRa公司;蛋白胨和酵母粉购自Oxoid公司;胎牛血清、DMEM培养液购自Solarbio公司;兔单克隆抗体LAMP1、山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488购自Abcam公司;细菌质粒DNA小提试剂盒购自Omega公司。常规生化试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计

利用GenBank 中鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 标准株PagC基因的启动子序列(PpagC)为模板进行设计:引物1(PpagC-F 5′-CGTGCGCAGTTAACCACTCTTAATAATAATG-3′)和引物2(PpagC-R 5′-GCTCTAGATACTACTTATTATTTACGGTGT-3′),由上海生工科技有限公司合成。

1.4 重组质粒的构建

以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为模板,扩增PpagC片段。将PpagC片段克隆到pMD18-T载体,并转化大肠杆菌,使用Omega试剂盒提取质粒,XbaⅠ、FspⅠ限制性内切酶切下PpagC、EGFP片段后相连接,获得重组质粒并命名为pPpagC-EGFP。重组质粒转化大肠杆菌后使用Omega试剂盒提取质粒并进行PCR和酶切鉴定,阳性菌株进行测序。测序引物为5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′。

1.5 荧光菌株的构建及鉴定

重组质粒pPpagC-EGFP在2.0 kV电压下电击4 ms,使其转化进入鼠伤寒沙门氏菌感受态细胞。挑选转化子进行测序验证,测序引物同上。阳性菌株标记为Sal-pPpagC-EGFP,并使用荧光显微镜观察。另设空白质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌作为对照。

1.6 重组荧光沙门氏菌Sal-pPpagC-EGFP的生物学性状

1.6.1 Sal-pPpagC-EGFP的稳定性检测 挑取Sal-pPpagC-EGFP单克隆分别划线于LB固体培养基(含有30 μg/mL Km)和LB固体培养基中,置37 ℃培养箱培养,每12 h移植1次,连续20次,分别于第3,6,9,12,15,18,20次,挑取单克隆制作涂片于荧光显微镜下观察EGFP荧光信号。

1.6.2 Sal-pPpagC-EGFP的生长曲线测定 按照 1%的比例将Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028新鲜培养物分别接入含有 30 μg/mL Km的LB 液体培养基和无Km的LB 液体培养基中。置 37 ℃、180 r/min 恒温摇床振荡培养,每隔 1 h 取样,采用酶标仪读取OD600值,试验重复 3 次,并绘制生长曲线。

1.6.3 Sal-pPpagC-EGFP的半数致死量(LD50)测定 将荧光株Sal-pPpagC-EGFP和野生株Sal-14028培养至对数生长期,收集菌体,灭菌PBS洗涤3次,以灭菌PBS重悬菌液,分光光度计测定菌液浓度。130只8周龄BALB/c雌性小鼠,随机分为3组,第1组为Sal-pPpagC-EGFP攻毒组,分别以108,107,106,105,104cfu/mL的剂量腹腔注射BALB/c小鼠,每个剂量重复12只。第2组为Sal-14028攻毒组,分别以108,107,106,105,104cfu/mL的剂量进行腹腔注射BALB/c小鼠,每个剂量重复12只。第3组为生理盐水对照组,10只小鼠给予腹腔注射同体积生理盐水。连续观察21 d,记录BALB/c小鼠的死亡情况,使用改良寇氏法计算Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028的LD50。

1.7 荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP在猪肺泡巨噬细胞3D4/21中的示踪初探

1.7.1 细胞和菌株培养 猪肺泡巨噬细胞3D4/21在37 ℃、5% CO2条件下培养于DMEM+10% FBS中。按照106/孔密度将细胞接种于12孔板中,Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028培养至对数生长期,用灭菌PBS洗涤并调整浓度,以MOI=10的感染指数侵染细胞,细菌与细胞孵育30 min后加入含50 μg/mL终浓度多粘菌素的新鲜培养基继续培养。

1.7.2 免疫荧光试验 将感染3,6 h的3D4/21细胞用PBS洗涤3次后,以4%多聚甲醛固定10 min,0.1% TritonX-100透化10 min。细胞再次经PBS洗涤后,用5% BSA封闭60 min。将细胞与稀释好的LAMP1一抗(1∶200)室温反应2 h,再与山羊抗兔二抗(1∶400)37 ℃孵育45 min,然后用PBS缓冲液洗涤,DAPI染色3 min后洗涤3次,最后滴加抗荧光猝灭剂封片,进行显微镜分析。野生株Sal-14028感染细胞作为对照。

2 结果与分析

2.1 重组质粒的构建及鉴定

2.1.1PpagC片段的扩增 为使质粒pET28a-EGFP在沙门氏菌中稳定表达和复制,本研究计划将沙门氏菌PagC基因的启动子序列(PpagC)克隆并替换pET28a-EGFP中的T7启动子,并将PpagC、EGFP片段连接到pET28a-EGFP质粒的XbaⅠ、FspⅠ位点(图1),以期重组菌株具备稳定发光的特征。试验中以鼠伤寒沙门氏菌14028菌液为模板,分别用上下游引物PpagC(F1)、PpagC(R2)扩增,结果扩增出716 bp片段(图2-A),片段长度与预期相符。

图1 pPpagC-EGFP质粒结构图谱Fig.1 Structural mapping of pPpagC-EGFP plasmid

2.1.2 重组质粒酶切鉴定 用限制性内切酶XbaⅠ、FspⅠ双酶切重组质粒PMD18-PpagC和pET28a-EGFP,得到约716 bp的PpagC片段和4 184 bp的pET28a-EGFP片段(图2-B),连接后得到重组质粒pPpagC-EGFP再次双酶切获得约716 bp的PpagC片段和4 184 bp的pET28a-EGFP片段(图2-C)。

A.PCR扩增PpagC片段:M.DNA Marker DL2000;B.pMD18T-PpagC、pET28a-EGFP双酶切电泳图,琼脂糖凝胶浓度为1.5%:1.pET28a-EGFP,2.pMD18T-PpagC,M.DNA Marker DL2000;C.重组质粒pPpagC-EGFP双酶切(FspⅠ和Xba Ⅰ)电泳图,琼脂糖凝胶浓度为1.5%:1.原质粒,2—3.酶切质粒,M.DNA Marker DL2000。A.PCR amplification of PpagC promoter fragment:M.DNA Marker DL2000;B.pMD18T-PpagC,pET28a-EGFP double digestion 1.5% agarose gel electrophoresis map:1.pET28a-EGFP,2.pMD18T-PpagC,M.DNA Marker DL2000;C.1.5% agarose gel electrophoresis plot of recombinant plasmid pPpagC-EGFP double digested(Fsp Ⅰ and Xba Ⅰ)product:1.The original plasmid,2—3.The digested plasmid,M.DNA Marker DL2000.图2 PpagC片段PCR扩增和pMD18T-PpagC、pPpagC-EGFP的酶切鉴定Fig.2 PCR Amplification of PpagC fragment and validation of pMD18T-PpagC and pPpagC-EGFP by enzymatic cleavage

2.2 鼠伤寒沙门氏菌Sal-pPpagC-EGFP菌株的测序鉴定及荧光检测

2.2.1 Sal-pPpagC-EGFP菌株的测序鉴定 阳性菌株菌液委托上海生工科技公司测序,结果表明,重组质粒pPpagC-EGFP成功转入鼠伤寒沙门氏菌14028。部分测序峰图见图3。

2.2.2 Sal-pPpagC-EGFP菌株的荧光鉴定 挑取电转后的鼠伤寒沙门氏菌和空白对照单克隆制备菌液涂片,在荧光显微镜下观察,可见强烈的绿色荧光(图4-A),右图为空白对照,在激发光下无可见荧光(图4-B)。说明增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)已成功转入鼠伤寒沙门氏菌14028,阳性转化子命名为Sal-pPpagC-EGFP。

测序引物为5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′。The sequencing primer is 5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′.图3 pPpagC-EGFP质粒测序峰图(第一部分)Fig.3 pPpagC-EGFP plasmid sequencing peak map(part 1)

A.Sal-pPpagC-EGFP鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下的图片(激发488 nm/发射507 nm、100×);B.空白对照在荧光显微镜下的图片(激发488 nm/发射507 nm、100×)。A.Picture of Sal-pPpagC-EGFP Salmonella typhimurium under fluorescence microscope(excitation 488 nm/emission 507 nm,100×);B.Blank control under fluorescence microscope(excitation 488 nm/emission 507 nm,100×).图4 标记EGFP的沙门氏菌的荧光图Fig.4 Fluorescence map of salmonella labeled with EGFP

2.3 Sal-pPpagC-EGFP的生物学特性

2.3.1EGFP表达的稳定性检测 连续20次转接划线后检测Sal-pPpagC-EGFP的荧光信号,结果表明,在不同的时间点,不论含抗生素或不含抗生素培养基上的单克隆都保持强烈的荧光,且菌落数量无较大差异,说明pPpagC-EGFP在Sal-14028中稳定表达EGFP,且不受抗性选择的影响。

2.3.2 荧光菌株的生长曲线 在相同培养条件下,荧光菌株与野生菌株生长曲线的变化趋势基本相同,都在2 h后进入指数期,约10 h后进入稳定期(图5)。结果表明,pPpagC-EGFP质粒、卡那霉素的存在及EGFP的表达对宿主菌的生长没有明显影响。

图5 Sal-14028和Sal-pPpagC-EGFP的生长曲线比较Fig.5 Comparison of the growth curves of Sal-14028 and Sal-pPpagC-EGFP

2.3.3 半数致死量(LD50)测定 使用改良寇氏法计算出Sal-pPpagC-EGFP的LD50为1.20×106cfu/mL,Sal-14028的LD50为1.45×106cfu/mL,两者毒力无显著差异(P>0.05)(表1),结果表明,EGFP基因的插入对荧光株的毒力无明显影响。

表1 8周龄小鼠腹腔注射Sal-14028、Sal-pPpagC-EGFP菌株后LD50的测定Tab.1 Determination of LD50 after intraperitoneal injection of Sal-14028 and Sal-pPpagC-EGFP strains in 8-week-old mice

2.4 猪肺泡巨噬细胞3D4/21中吞噬溶酶体与荧光沙门氏菌的共定位

沙门氏菌在488 nm波长的激发光下发出绿色荧光信号,Alexa Fluor 488标记的溶酶体蛋白LAMP1在495 nm波长的激发光下发出红色荧光信号(图6)。结果表明,沙门氏菌侵袭进入了3D4/21细胞,溶酶体广泛表达在细胞质中,且与包含沙门氏菌的吞噬体发生共定位,吞噬体中沙门氏菌的EGFP荧光信号未受免疫荧光相关试剂、吞噬体膜和细胞膜的影响。

图6 荧光沙门氏菌在3D4/21中与吞噬溶酶体共定位情况(100×)Fig.6 Co-localization of Salmonella fluorescens with phagocytic lysosomes in 3D4/21(100×)

3 结论与讨论

鼠伤寒沙门氏菌是一种高致病力、兼性胞内感染的革兰氏阴性细菌,是重要的人畜共患病原体之一,可导致人类和动物肠胃炎、猪败血症和死亡等。然而鼠伤寒沙门氏菌在宿主体内散播的分子机制尚待进一步确定。目前对鼠伤寒沙门氏菌的研究主要集中在对其致病因子表达调控网络,毒力因子特异抗体的制备,新型药物靶点的寻找等[12-13],沙门氏菌在宿主细胞内的示踪及其在感染细胞内的行为状态是开展上述研究的重要基础。本研究通过基因重组构建了EGFP标记的荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP,并评估了EGFP和Km基因的引入对鼠伤寒沙门氏菌 14028生物学特性和毒力的影响。另外,验证了Sal-pPpagC-EGFP在猪肺泡巨噬细胞中的定位示踪作用。本研究结果表明,Sal-pPpagC-EGFP是研究鼠伤寒沙门氏菌致病机制的潜在工具。

一些GFP质粒已成功用于标记某些沙门氏菌,但均存在缺点和限制。目前,荧光沙门氏菌菌株多基于pUCP18、pKK223系列质粒构建,如ATCC公司的Salmonella14028GFP菌株采用的是pUCP18MCSgfpmut3质粒转化沙门氏菌所得,其荧光信号较强,但该菌株所含荧光质粒的结构尚未见报道,且国内难以获得。pPpagCGFP_OVA和pPtacCGFP_OVA 质粒是应用较为成功的沙门氏菌荧光质粒,但主要针对SL1344缺陷型沙门氏菌菌株设计[14]。此外,研究报道pACYC和pSIF等载体中四环素抗性基因可影响吞噬入胞内的沙门氏菌的存活和生长[15]。以上质粒的优缺点为进一步优化构建荧光沙门氏菌提供了基础数据,也是本研究以PagC基因的启动子序列(PpagC)和pET28a-EGFP质粒为基础,并引入卡那霉素抗性基因,作为研究切入点的重要原因。

荧光质粒在沙门氏菌胞内的稳定性与质粒携带的EGFP基因和Km抗性基因对细菌生长、毒力、胞内存活等生物学特性的影响是以PpagC和pET28a-EGFP质粒为基础的荧光沙门氏菌能否成功应用的关键。大肠杆菌与沙门氏菌由一个祖先分化而来[16],此外,在大肠杆菌基因岛OI-122中同样存在毒力基因PagC,并与沙门氏菌毒力基因PagC具有显著同源性[17-18]。因此,本研究基于大肠杆菌来源的PET28a-EGFP构建的pPpagC-EGFP质粒能够在沙门氏菌中稳定传代。GFP的最大优点是不损害标记对象,在细菌致病性研究中具有潜在用途。Valdivia 等[19]构建了GFP表达载体并在肠道病原体和鼠伤寒沙门氏菌中进行测试,结果表明,GFP表达不会对细菌存活产生不利影响,也不会损害细菌进入哺乳动物细胞或在巨噬细胞内存活的能力。本研究成功利用EGFP标记了鼠伤寒沙门氏菌 14028,并对其生长特性和毒力进行检测,结果表明荧光株与野生株的生长曲线和毒力无显著差异,与文献报道结果一致。有研究报道,浓度为15～150 μg/mL的氨基糖苷类(卡那霉素)抗生素不会降低胞内沙门氏菌存活和增殖的能力[20]。本研究证明了pPpagC-EGFP衍生的卡那霉素抗性基因不会影响沙门氏菌在胞内存活与增殖的能力。试验中,荧光显微镜观察菌株Sal-pPpagC-EGFP在吞噬溶酶体中的定位情况,发现其侵染3D4/21细胞3 h后定位于溶酶体,并于6 h后增殖。说明一定时间范围内,随着感染时间增长,胞内沙门氏菌数量增多。本研究进一步揭示了,Km抗性基因标记的以PpagC和pET28a-EGFP质粒为基础的Sal-pPpagC-EGFP可作为研究沙门氏菌致病机制的潜在工具。

本研究成功构建启动子序列为14028标准沙门氏菌源性的pPpagC-EGFP质粒,电转后获得荧光菌株Sal-pPpagC-EGFP。通过细菌侵染试验,初步了解其在猪肺泡巨噬细胞内与吞噬溶酶体的共定位情况及存活稳定性。为进一步阐明沙门氏菌致病机制奠定基础,提供了实时观测胞内细菌行为状态的有效生物材料。