自制糖化血红蛋白质控品及其临床应用

王加平,王娜,傅美丽,李恒星,胡明

(东海县人民医院检验科,江苏连云港222300)

糖化血红蛋白A1c(glycated hemoglobin A1c,HbA1c)反映糖尿病患者2～3个月平均血糖水平,在糖尿病诊断、疗效判断等方面具有重要意义。我国糖尿病学会已将HbA1c列入糖尿病诊断指标。为了减轻患者就医费用,国家卫生健康委积极推进检验结果互认,互认的基础首先要保证检验结果的可靠性和一致性,质量控制是实现这一目标的重要手段。开展质量控制的前提是要有良好的质控品,目前市场上主要有伯乐、朗道、昆涞公司的HbA1c商品化质控品,因其价格昂贵,也有实验室用糖尿病患者血液自行制备质控品[1-3]。本研究尝试用健康体检者静脉血液标本制备异常浓度的HbA1c质控品用于室内质控,获得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂 D-10糖化血红蛋白仪及配套试剂(美国伯乐公司);迈瑞5390血细胞分析仪及配套试剂(深圳迈瑞公司);0.1 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液;牛血清清蛋白(新西兰Prollat公司);葡萄糖(成都科隆化学品公司);海藻糖(罗恩试剂公司);Proclin 300防腐剂(美国Sigma公司)。

1.2标本来源 收集2021年3月东海县人民医院健康体检中心体检健康者EDTA-K2抗凝静脉血标本,所有标本HBV、HCV、HIV阴性。

1.3方法

1.3.1高值HbA1c生成 将EDTA-K2抗凝血标本800×g离心15 min,弃上层血浆,用生理盐水洗涤红细胞3次,将各管红细胞混合。加入与红细胞体积等量的1∶10稀释0.1 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液,充分混匀。加入终浓度为555.6 mmol/L葡萄糖,37 ℃温育48 h,HbA1c达到预期目标浓度(13.0%～16.0%)后将血红蛋白液放入透析袋中,置于0.05 mol/L pH 6.80磷酸盐缓冲液中,4 ℃透析24 h,中间换缓冲液1次。

1.3.2不同水平糖化血红蛋白质控品配制 分别配制3个浓度水平质控品,水平1(目标值:5.0%～6.0%),体检健康者血红蛋白混合而成;水平2(目标值:9.0%～10.5%)和水平3(目标值:13.0%～16.0%),分别用水平1与1.3.1过程中生成的高值HbA1c混合而成,血红蛋白浓度控制在100～120 g/L。在配制完成的3个浓度水平血红蛋白液中分别加入保护剂牛血清清蛋白(20～60 g/L)、海藻糖(79.2～264.3 mmol/L)、Proclin 300(0.01%),分装后-20 ℃冰冻保存。

2 实验与结果

2.1葡萄糖浓度及温育时间对HbA1c生成的影响 在血红蛋白液中分别加入终浓度55.6、277.8、555.6、833.3、1 111.1 mmol/L葡萄糖,观察葡萄糖浓度及温育时间对体外HbA1c生成的影响,结果见表1,葡萄糖浓度≤55.5 mmol/L时,37 ℃温育24～72 h,HbA1c几乎没有变化;葡萄糖终浓度555.6 mmol/L时,温育48 h后HbA1c即达16%(预期目标值13.0%～16.0%),温育72 h,HbA1c稳定不变,但血红蛋白颜色变为棕褐色,综合考虑,最终选择葡萄糖浓度为555.6 mmol/L,温育时间48 h。

表1 不同终浓度葡萄糖温育24、48、72 h后HbA1c浓度

2.5长期稳定性观察 将自制的质控品作为室内质控品进行临床应用1年,按照常规质控方法,每天测定1次,结果见表2。水平1、水平2、水平3的月平均CV分别为2.46%～3.12%、1.63%～2.11%、1.25%～2.87%,年平均CV分别为2.97%、1.92%、2.25%。与初始检测值(5.7%、9.0%、13.6%)比较,月平均值偏倚分别为0～1.75%、-1.11%～1.11%、-0.73%～0.73%,偏倚均<1/2 TEa(符合美国CLIA′88可接受性能指标规定)。

表2 长期稳定性观察

3 讨论

目前临床上使用的质控品大多为商品化冻干品,国内也有自制质控品的报道[3-4],其由临床上HbA1c正常或异常标本直接制备,且最多只有2个水平,大多为1个水平。HbA1c是葡萄糖与血红蛋白β珠蛋白链末端缬氨酸残基结合生成的稳定化合物[5]。根据此原理,本研究通过在健康体检者静脉血标本中加入高浓度葡萄糖温育方法获得高值HbA1c,结果表明,HbA1c生成与葡萄糖浓度和温育时间相关,葡萄糖终浓度为555.6 mmol/L时,温育48 h HbA1c即达到预期目标值。随着葡萄糖浓度和温育时间的延长,HbA1c浓度会略有增加,但血红蛋白的色泽变为褐色,会影响后续的质控品保存,因此本研究最终选择葡萄糖终浓度为555.6 mmol/L,温育时间48 h。

质控品的重要质量指标是开瓶稳定性、瓶间均匀性和长期保存稳定性,本研究自制质控品-20 ℃冰冻保存至少可以稳定1年,开瓶后4 ℃保存至少稳定14 d,瓶间均匀性CV<2%,反复冻融8次不影响结果,通常的蛋白类质控品应避免反复冻融,由于本研究在质控品中加入保护剂海藻糖,有效地保护了冻融对HbA1c的影响,因而更方便基层工作量较小的医院使用。

采用健康体检者血标本制备异常值糖化血红蛋白,相较于国内报道的直接用糖尿病患者标本来讲,标本更易得到,来源更方便,方法更简单,也便于推广使用。在制备的质控品中加入适当的稳定剂和防腐剂,延长稳定时间,能够更好地满足临床使用,同时也可以降低成本。