高效液相色谱法测定蜂蜜中氧氟沙星残留

◎ 高倩妮，魏超田，陆 宁，姚梦靖，周晓龙

（1.亳州学院 生物与食品工程系，安徽 亳州 236800；2.药食同源功能食品亳州市重点实验室，安徽 亳州 236800）

由于蜂蜜具有保健作用的特殊性，其质量问题被广大消费者关注。为了避免虫害，蜂农会给蜜蜂身上喷晒抗菌药——氧氟沙星，氧氟沙星是属于喹诺酮类中的一种具有广谱性的抗菌药[1]，蜂蜜在养殖加工过程中如检测出氧氟沙星则被判定不合格[2]。近年来，蜂蜜中喹诺酮类检出率也有逐年增加的趋势，学术研究者不断探索蜂蜜中氧氟沙星的检测方法[3]。目前，测定氧氟沙星残留量的方法有免疫芯片法[4-5]、气相色谱法[6]、气相质谱色谱联用法[7]、高效液相色谱-串联质谱方法[8]。质谱法的检出限最低，但操作复杂、烦琐、耗时且设备条件和成本大。因此，质谱法难以普及。由于蜂蜜有一定的粘稠特性，所以，不能使用畜产品的前处理方法。本文研究前处理方法，固相萃取蜂蜜中的氧氟沙星，探究流动相组成、流速和比例，研究开发高效液相色谱法测定氧氟沙星，其方法简单、成本低、效率高、实用性强，为快速检测蜂蜜产品中的目标物含量提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氧氟沙星的标准液（100 μg·mL-1，坛墨质检科技股份有限公司），乙腈（色谱纯）、无水硫酸镁、甲酸、乙酸、氢氧化钠、磷酸氢二钾均为国药分析纯，蜂蜜市售。

1.2 仪器设备

HPLC（世尔科技有限公司）；固相萃取仪（天津东康科技有限公司）；FN-12W 型氮吹仪（天津富达科技有限公司）；YP-5006 型百分之一天平（上海越平科技仪器有限公司）；AcclaimTMPolarAdvantage II C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.3 实验方法

1.3.1 氧氟沙星标准溶液配制

准确量取200 μL 氧氟沙星标液（100μg·mL-1），用0.2%甲酸水溶液定容至1 mL 配制成20.00μg·mL-1标准储备液，储备于冰箱中备用。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱为C18柱；检测波长为280 nm 的激发波长，450 nm 的发射波长；柱温为30 ℃；流速为1.5 mL·min-1；进样量为10 μL；流动相体积比例为13:87（流动相A 为乙腈，流动相B 为0.2%甲酸水溶液）。依据以上色谱条件，检测流动相种类（乙腈/0.2%甲酸、0.05 mol·L-1磷酸溶液/三乙胺-乙腈），流速及流动相比例，样品不同前处理等因素对氧氟沙星分离效果的影响，确定最终色谱条件，通过标准曲线测定、精密度实验、回收率测定考察仪器方法的精密性、准确性和稳定性。

1.3.3 蜂蜜样品处理

蜂蜜稀释液的选择，一般样品分别用水、0.02 mol·L-1的氢氧化钠和Mallvaine pH 为4.0 的缓冲液溶解蜂蜜，再用0.5%乙酸乙腈提取氧氟沙星。用2 mL 甲醇、磷酸缓冲盐分别预淋萃取柱，上清液过柱，甲醇洗脱，吹至近干，定容至2 mL，过0.45 μm 有机滤膜。

研究提取液对氧氟沙星提取量的影响，提取液为0.05 mol·L-1磷酸缓冲盐、0.5%乙酸的乙腈和乙腈+水（8:2）混合溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

2.1.1 流动相的选择

流动相为磷酸溶液/三乙胺-乙腈时，氧氟沙星出峰时间较为延迟，为10.776 min，且基线不稳定，杂峰较多，分离效果不好；流动相为甲酸—乙腈时，氧氟沙星出峰时间为7.773 min，节约时间且基线稳定，有对称尖锐的峰型，分离效果较好，信噪比更高，定甲酸水溶液和乙腈（87:13）为选择流动相进行等度洗脱，时间为18 min。

2.1.2 流速优化

目标物出峰时间随流速增加而缩短，出峰时间为6.775 min，此时流速为1.8 mL·min-1，峰前有拖尾的状况，有明显现象，基线不稳；流速为1.2 mL·min-1时，峰前拖尾现象，明显基线不稳，出峰时间为8.626 min；流速为1.5 mL·min-1时，出峰时间为7.648 min，出现无拖尾现象且锋型较为尖锐对称的峰图，因此，最终选择1.5 mL·min-1的流速。

2.2 优化样品前处理条件

2.2.1 确定初方法

以磷酸缓冲盐、乙酸的乙腈和乙腈+水（8:2）混合溶液为蜂蜜中氧氟沙星的提取液，同体积添加的3种提取液中的氧氟沙星含量经高效液相测定结果分别为0、1.152 0 和0.951 9 ng·g-1，故选择氢氧化钠溶液作为蜂蜜样品中稀释液，乙酸的乙腈溶液作为蜂蜜稀释液中氧氟沙星的提取液。

2.2.2 方法的进一步确定与优化

研究分析两因素对实验结果的影响，结果分析表见表1。由表1 可知，氢氧化钠: 蜂蜜=1:1，蜂蜜: 乙酸乙腈=1:5 时，提取效果最佳，提取量为1.612 ng·g-1。

表1 氢氧化钠和乙酸乙腈溶液对提取氧氟沙星的影响表ng·g-1

2.3 仪器方法验证

2.3.1 标准曲线及线性范围

将氧氟沙星标准液的浓度配制成0.016、0.032、0.080、1.000、10.000、20.000 μg·mL-1。纵坐标（Y)为峰面积，横坐标为进样浓度（X)，拟合标曲方程为：Y=737 745.075 9X-33 501.592 5，R2=0.997 6。在0.016～20.000 μg·mL-1浓度范围内，线性关系良好。

2.3.2 精密度与检出限

测定6 次，吸取标液0.032 μg·mL-1得到组分为2.24%的相对标准偏差（RSD）。添加0.8 μg·kg-1标液于空白蜂蜜基质，信噪比（S/N)＞10，说明定量限可达到0.8 μg·kg-1，该方法可以满足分析要求。

2.3.3 回收率实验

取100 μL 的0.05、0.10 和0.5 μg·mL-1的标液放入5 g 蜂蜜空白样中，做3 次加标回收重复试验。回收率为84.38%～99.41%，相对标准偏差RSD 为2.25%，满足线性分析要求。

3 结语

将方法应用于市场，在市场上的蜂蜜样品中选取5 种品牌3 个种类的椴树蜂蜜、洋槐蜂蜜及老蜂蜜检测，共抽检了5 份。优化后的色谱条件：流动相为乙腈-2%甲酸水溶液（13:87），1.5 min·L-1的流速，35 ℃的柱子温度，280 nm，450 nm 发射波长。此方法条件下，检测氧氟沙星0.8 μg·kg-1的检出限，在0.016 ～20.000 μg·mL-1浓度范围内氧氟沙星测定呈良好的线性关系，相关系数R²=0.997 6，加标回收率为84.38%～99.41%，本方法能够满足残留分析的要求。一种简便准确又快捷的方法，检测蜂蜜及类似产品中可能存在的氧氟沙星残留量，一定程度上可以保障蜂蜜产业的安全生产。