不同粒径聚苯乙烯微球对长额象鼻溞的毒性效应

于国欣，邵旭东，曾平平，张清靖，曲疆奇，刘青*

(1.大连海洋大学 辽宁省水生生物重点实验室，辽宁 大连 116023；2.北京市农林科学院水产科学研究所 渔业生物技术北京市重点实验室，北京 100068)

塑料制品在人类生活中的应用越来越广泛，并发挥着不可替代的作用。据统计，2018年全球塑料制品总量超过3.95 亿t。生活中被遗弃的塑料制品，经过物理、化学和生物降解作用，会进一步分解形成粒径小于5 mm的塑料碎片，即微塑料[1]，并进入水环境[2]。微塑料垃圾遍及全球水域，在太平洋、大西洋及印度洋均已被检测到。其中，南太平洋微塑料的丰度达到2.7×104个/km2[3]。北美五大湖流域，漂浮在水面的微塑料平均丰度高达4.3×104个/km2[4]。中国近海岸、海滩及各淡水流域亦有许多微塑料分布的报道[5-6]。其中，广东沿海沉积物中微塑料的丰度高达6 838 个/m3[7]，长江三峡水库水体表层的微塑料丰度为12.611～1 597 个/m3[8]，武汉北湖水体中的微塑料丰度达到(8 925±1 591)个/m3[9]，位于青藏高原东部农业区的湟水河中，微塑料的丰度高达 665～8 780 个/m3[10]。

微塑料具有粒径小、比表面积大、疏水性强和难降解等物理化学特性[11]，水体大量赋存会对生物产生毒性效应，包括改变摄食和繁殖量，降低存活率和诱导氧化应激反应，甚至导致生物死亡[12-13]。Chae等[14]研究表明，微塑料富集在浮游动物大型溞(Daphniamagna)的肠道内，可从大型溞转移到较高营养级的中华青鳉(Oryziassinensis)鱼体中，即微塑料不仅对生物产生毒性效应，还可以沿着食物链传递，对更高营养级的生物产生影响。此外，微塑料的成分、形状、尺寸和表面特征等性质的差异，均会对水生生物造成不同程度的毒性效应。据Eltemsah等[15]报道，在粒径为6 μm 的聚苯乙烯微球下暴露48 h，对大型溞无急性毒性，但暴露120 h后会引起大型溞死亡；Rehse等[16]研究了两种粒径范围的聚乙烯微粒(PE)对大型溞的毒性效应，结果表明，1～10 μm PE对大型溞有毒性作用，90～100 μm PE对大型溞无明显毒性作用；方海燕等[17]研究发现，在聚氯乙烯微粒(PVC)暴露下，大型溞繁殖能力下降；Zhang等[18]研究发现，在纳米级微塑料暴露下，蚤状溞(Daphniapulex)的繁殖能力减弱且繁殖模式发生改变。但De Felice等[19]研究却发现，在微米级微塑料暴露下，大型溞体形变大，后代数量明显增加。上述研究结果均表明，微塑料对水生生物的毒性效应还存在着较多不确定因素，故需要进一步研究。

长额象鼻溞(Bosminalongirostris)为节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)枝角目(Diplostraca)象鼻溞科(Bosminidae)象鼻溞属(Bosmina)的浮游动物，其个体小，不及溞属的大型溞、蚤状溞的1/3[20]，广泛分布于湖泊、水库等水体中，营养丰富，为滤食性鱼类的天然饵料，在中、富营养水体中密度较高[21]，但微塑料对其毒性的研究鲜见报道。本研究中，分析了不同粒径聚苯乙烯微球对长额象鼻溞的生物毒性效应，以期为水域生态风险评价提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

3种聚苯乙烯微球(PS)粒径分别为0.5、5、20 μm，密度均为1.05 g/cm3，购自上海辉质生物科技有限公司，置于4 ℃冰箱中避光保存。长额象鼻溞采自北京市密云水库，分离后单种培养，每日投喂离心斜生栅藻(Tetradesmusobliquus)，每3 d换水1次，在光照培养箱暂养6个月以上。

1.2 方法

1.2.1 PS对长额象鼻溞的急性毒性试验 试验开始前，将长额象鼻溞置于(22±1)℃、光暗比12L∶12D的光照培养箱中培养。将不同粒径的PS配制成质量浓度为0.001 g/mL的储备液，经超声波均匀处理30 min后，于4 ℃冰箱中避光保存。

根据预试验结果，3种粒径的PS对长额象鼻溞的急性毒性试验浓度设置略有不同，0.5 μm与5 μm粒径的PS质量浓度均设置为0、5、10、15、20、25、30 mg/L，20 μm粒径的PS质量浓度设置为0、10、20、30、40、50 mg/L。

将配制的PS储备液稀释至试验浓度，并用超声波处理30 min后置于培养箱(22 ℃)中。在体式显微镜下挑选出溞龄小于24 h的长额象鼻溞，并将其饥饿处理24 h。在6孔细胞培养板的每孔中添加10 mL PS稀释液，每孔放入10只长额象鼻溞，每个PS浓度设置3个细胞培养板，即3组平行。试验持续72 h，每隔24 h观察长额象鼻溞的死亡情况，长额象鼻溞在15 s内不发生活动即判定为死亡，试验结束后，将所有试验长额象鼻溞固定保存。

1.2.2 PS对长额象鼻溞的慢性毒性试验 根据急性毒性试验48 h LC50的千分之一浓度设置慢性毒性试验浓度[22]，在6孔细胞培养板的每孔中添加10 mL PS稀释液，在体式显微镜下挑选出溞龄小于24 h的长额象鼻溞，置于对应浓度的6孔细胞培养板中(每孔1只)，每个PS浓度设置5个细胞培养板，即5组平行，每天更换稀释液，摄食密度为0.6 mg C/(L·d)的离心斜生栅藻，观察并记录每板每孔中长额象鼻溞母体的存活及产幼情况，及时取出死亡长额象鼻溞母体和新产出的幼溞固定保存。待所有母体死亡后结束试验，并用显微镜观察测量所有长额象鼻溞母体、第一胎和第二胎幼溞的体长(BL)、体高(BH)、触角长(AL)及壳刺长(SL)等形态参数。

1.2.3 内禀增长率及种群增长参数的计算 采用Lotka提出经Birch和林昌善简化的公式[23]计算内禀增长率。内禀增长率(rm)、净生殖率(R0)、世代周期(T)和周限增长率(λ)计算公式为

T=lnR0/rm，λ=erm。

其中：x为日龄(d)；lx为x日龄时的存活率(%)；mx为x日龄时的出生率(%)。

1.3 数据处理

试验结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同粒径PS处理下长额象鼻溞的急性致死效应

从表1可见：粒径为0.5 μm的PS对长额象鼻溞的24 h急性致死率较低，最高为24.45%，各PS浓度组间无显著性差异(P>0.05)，但PS组与对照组间有显著性差异(P<0.05)；48 h时致死率随PS浓度的增加而增大，高质量浓度组(25、30 mg/L)与低质量浓度组(5～20 mg/L)间有显著性差异(P<0.05)；当试验进行至72 h时，除对照组外，其余各组的死亡率均超过70%，最高达到85.56%。

表1 0.5 μm PS对长额象鼻溞的急性致死率Tab.1 Acute mortality of 0.5 μm polystyrene microplastics to Bosmina longirostris

从表2可见：粒径为5 μm 的PS对长额象鼻溞的24 h时急性致死率最高为24.44%，各PS浓度组间无显著性差异(P>0.05)；48 h时致死率随PS浓度的增加而增大，高质量浓度组(25、30 mg/L)与低质量浓度组(5～20 mg/L)间有显著性差异(P<0.05)；当试验进行至72 h时，各PS浓度组均表现出较高的致死率，最高达90.00%。

表2 5 μm PS对长额象鼻溞的急性致死率Tab.2 Acute mortality of 5 μm polystyrene microplastics to Bosmina longirostris

从表3可见：粒径为20 μm 的PS对长额象鼻溞的24 h时急性致死率随PS质量浓度的升高而上升，30 mg/L以上高质量浓度组与10 mg/L质量浓度组间有显著性差异(P>0.05)；48、72 h时的急性致死率较粒径为5 μm 时有所降低，最高分别为48.89%和85.56%。

表3 20 μm PS对长额象鼻溞的急性致死率Tab.3 Acute mortality of 20 μm polystyrene microplastics to Bosmina longirostris

图1为3种粒径的PS对长额象鼻溞48 h急性致死率的回归曲线，3种不同粒径的PS浓度与长额象鼻溞的急性致死率间存在线性关系，且不同粒径PS对应的曲线斜率不同，其中，5 μm PS对应曲线斜率最大，20 μm PS对应曲线斜率最小。由回归方程计算出粒径为0.5、5、20 μm 的PS 48 h LC50分别为21.65、19.26、47.61 mg/L。

图1 3种粒径PS对长额象鼻溞的48 h急性致死效应Fig.1 48 h acute lethal effect of polystyrene microplastics with three particle sizes on Bosmina longirostris

2.2 不同粒径PS处理下长额象鼻溞形态的变化

在PS质量浓度为21.65(粒径为0.5 μm)、19.26(粒径为5 μm)、47.61 μg/L(粒径为20 μm)下进行长额象鼻溞形态及种群变化试验。各粒径PS组长额象鼻溞母体体形较对照组变大，其体长和体高均显著大于对照组(P<0.05)，体长最大值出现在20 μm PS组，为348.76 μm，体高最大值出现在0.5 μm PS组，为308.38 μm；各粒径PS组母体的触角长度较对照组显著缩短(P<0.05)；壳刺长度亦呈缩短趋势，5 μm PS组与对照组间有显著性差异(P<0.05)(图2(a))。

标有不同字母者表示同一指标下不同组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。The means with different letters in the same index are significant differences in different groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences.图2 不同粒径PS对长额象鼻溞母体及子代形态的影响Fig.2 Effects of polystyrene microspheres with different particle sizes on the morphology of parent and offspring of Bosmina longirostris

各粒径PS组第一胎幼溞的体长、体高均显著小于对照组(P<0.05)；5 μm PS组触角长度较对照组显著增大(P<0.05)；各粒径PS组壳刺长度均显著长于对照组(P<0.05)(图2(b))。

各粒径PS组第二胎幼溞的体长与对照组无显著性差异(P>0.05)；体高也趋于恢复，除5 μm PS组与对照组间有显著性差异(P<0.05)外，其他组均与对照组无显著性差异(P>0.05)；触角长与壳刺长变化基本一致，均为0.5、5 μm PS组较对照组显著增大(P<0.05)(图2(c))。

2.3 不同粒径PS处理下长额象鼻溞繁殖和种群的变化

从表4 可见：各粒径PS组长额象鼻溞的存活时间、一生生殖次数与总生殖量均显著大于对照组(P<0.05)；对照组长额象鼻溞的产前发育时间约为6 d，显著长于PS组(P<0.05)；0.5、5 μm PS组的每胎生殖量显著大于对照组(P<0.05)。

表4 不同粒径PS处理下长额象鼻溞的生活史参数Tab.4 Life cycle parameters of Bosmina longirostris treated with polystyrene microplastics with different particle sizes

从表5可见，3个PS组长额象鼻溞的内禀增长率、净生殖率和周限增长率均显著高于对照组(P<0.05)，而世代周期则显著低于对照组(P<0.05)。

表5 不同粒径PS处理下长额象鼻溞的内禀增长率及种群增长参数Tab.5 Intrinsic growth rate and population growth parameters of Bosmina longirostris under polystyrene microplastics treatment with different particle sizes

3 讨论

3.1 聚苯乙烯对长额象鼻溞急性致死的影响

水环境中赋存的微塑料对藻类的光合作用、生长，以及水生动物的摄食、繁殖和生存均造成了较大的影响。目前，有关微塑料对浮游动物的研究主要集中在溞属(大型溞、蚤状溞)和网纹溞属(Ceriodaphnia)，且随微塑料成分、粒径和暴露时间不同，结果不同。Eltemsah等[15]报道，在质量浓度为0～300 mg/L的PS下暴露48 h，对大型溞无急性毒性，但暴露120 h后可引起大型溞死亡；李勤等[24]研究了聚氯乙烯对大型溞的急性毒性，发现大型溞在24～48 h时死亡率较低，72～96 h时毒性上升，大型溞的心率随聚氯乙烯浓度的升高而降低，当质量浓度达到400 mg/L时，96 h时幼溞全部死亡。本研究表明，PS对长额象鼻溞的急性毒性均随PS浓度和暴露时间的延长而增大，与上述研究结果类似。

在本研究中，长额象鼻溞在0.5、5、20 μm 3种粒径下的48 h LC50分别为21.65、19.26、47.61 mg/L，表明3种粒径的PS毒性由大至小依次为5 μm>0.5 μm>20 μm，说明PS的粒径对长额象鼻溞的存活率均有显著影响。枝角类为滤食性生物，其滤食的食物大小随个体大小有一定差异。巩宁等[25]研究表明，大型溞可以摄入粒径为2、20、50 μm的PE，且对大型溞的毒性效应随粒径的增大而增大；Rehse等[16]也发现，大型溞可摄入粒径为1～10 μm的PE，但无法摄入粒径为90～100 μm的PE，这与大型溞可以摄食的藻类粒径范围为0.7～70 μm有关[26]。

长额象鼻溞个体小，体长通常为400～600 μm，为溞属大型溞、蚤状溞体长的1/3～1/4[20]，对于大粒径的食物难以摄取，在显微镜下也观察到，粒径为0.5、5 μm的PS在长额象鼻溞肠道内出现，说明长额象鼻溞可以摄入0.5、5 μm的PS，而20 μm大粒径的PS大多出现在其附肢、体表周围，难以被摄取，因而粒径为20 μm的PS对长额象鼻溞的急性毒性最弱。此外，微塑料的毒性与其在水蚤体内的含量及滞留时间有关。涂烨楠等[27]研究发现，大型溞对0.1、1.0、9.9 μm 3种不同粒径PS的平均排泄速率分别为8.2、7.8、3.4 个/min，即在可摄入范围内，排泄速率与微塑料粒径成反比，粒径越大排泄速率越低，积累量越大，因而其毒性越强。本研究中，长额象鼻溞可以摄入0.5、5 μm两种粒径的PS，相比0.5 μm粒径的PS，5 μm粒径的PS更加难以排泄，造成肠道的积累，故出现5 μm比0.5 μm PS毒性强的现象。

3.2 聚苯乙烯对长额象鼻溞形态的影响

微塑料会影响大型溞母体与子代的形态，但不同种类的微塑料影响却不同。李勤等[24]研究发现，暴露在PVC的大型溞，母体和子代的体长会变短；Besseling等[28]研究发现，纳米级微塑料(粒径为70 nm)对大型溞体长会产生负面影响，与对照组相比体长缩小了3.1%。而De Felice等[19]却得到了不同的研究结果，在低浓度的微塑料下暴露21 d后，大型溞的体长显著增加，比对照组增大了5%。该作者认为，体形增大的原因可能是在胁迫的环境条件下，大型溞能感知微塑料颗粒的存在，这些颗粒会阻塞消化道或抑制运动行为。为了清理肠腔、体腔和附着在身体表面及附肢上的微塑料颗粒，大型溞会增加自身运动行为，寻找利于生存的水环境，从而提高了对食物的摄取和吸收效率，故出现大型溞体形变大的现象。本研究结果与De Felice等[19]的研究结果类似，在低质量浓度(19.26～47.61 mg/L)的PS暴露下，PS组长额象鼻溞母体的体长和体高均显著大于对照组，这也可能是长额象鼻溞为保护种群生存的一种策略；但第一胎幼溞的体形却缩小，随着时间的延长，第二胎幼溞体形有恢复的趋势，这表明随着时间的延长，母体对水环境中的微塑料逐渐适应，从而减弱了PS对其的毒性作用，使得产出的后代逐渐恢复到正常水平，这也间接表明，水中低浓度的微塑料对长额象鼻溞的毒性持续时间较弱。

3.3 聚苯乙烯对长额象鼻溞繁殖和种群增长的影响

目前，关于微塑料对浮游动物繁殖的影响存在争议，不同研究者有不同的研究结果。有研究认为，微塑料可降低浮游动物的繁殖能力，如Besseling等[28]研究发现，在纳米级微塑料(粒径为70 nm)暴露下，大型溞的子代数量会降低；Zhang等[18]发现，在粒径为75 nm的微塑料暴露下，蚤状溞的繁殖能力降低且繁殖模式也发生改变；Iguchi等[29]研究发现，在苯乙烯二聚体和三聚体暴露下，网纹溞的繁殖率降低。也有研究认为，微塑料可增加浮游动物的繁殖能力，如De Felice等[19]研究发现，在微米级微塑料暴露下，大型溞的繁殖率会增加；Rist等[22]发现，在粒径为100 nm的微塑料暴露下，大型溞子代数量略有增加。还有研究认为，微塑料对浮游动物的繁殖能力无影响，如Canniff等[30]研究发现，在粒径为63～75 μm的微塑料暴露下，大型溞的生殖不产生显著变化。本研究表明，聚苯乙烯微球可以缩短长额象鼻溞产前发育期和世代周期，增加长额象鼻溞的一生生殖次数和总生殖量，并提高该溞的内禀增长率和净生殖率，说明PS可增加长额象鼻溞产幼数量。

物种以通过改变后代数量来抵御环境的变化是生物普遍的规律。长额象鼻溞产前发育时间的缩短及一生生殖次数的增加，直接造成PS组的子代数量高于对照组，这可能是长额象鼻溞对环境的适应性调节和对种群的保护策略[31]，这表明PS的存在确实会对长额象鼻溞的繁殖和种群产生影响。

4 结论

1)不同粒径的聚苯乙烯微球对长额象鼻溞的急性毒性均随着时间的延长和浓度的增加而增大。

2)0.5、5、20 μm 3种粒径聚苯乙烯微球对长额象鼻溞的48 h LC50分别为21.65、19.26、47.61 mg/L，表明粒径为5 μm 的聚苯乙烯微球对长额象鼻溞的急性致死率最高。

3)在聚苯乙烯微球暴露下，长额象鼻溞母体体形变大，第一胎幼溞体形缩小，随着繁殖代数的增加影响逐渐减弱，第二胎幼溞的体形有所恢复。

4)在聚苯乙烯微球暴露下，长额象鼻溞的寿命延长，产前发育期、世代周期缩短，净生殖率和内禀增长率提高，并产生更多的子代，这种影响与聚苯乙烯微球的粒径相关，并随粒径的增大而减弱。