基于气道神经源性炎症探讨翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘调节作用的实验研究

黄慧思，韩 超，石艳红，齐春丽，熊爱华，张秋玲，梁慧玲

（1.广州医科大学附属中医医院，广东 广州 510000；2.暨南大学，广东 广州 510000）

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）又名隐匿型哮喘，即以慢性干咳为惟一或重要症状的一种特定类别哮喘，为典型哮喘的前期状态［1-3］。目前西医上治疗CVA 主要包括吸入型糖皮质激素、支气管扩张剂和白三烯受体拮抗剂等［4］，但多数患者对长期服用糖皮质激素类药物感到有负担，且控制水平不理想，仍有部分患者进展为典型哮喘［5］。本院制造的翘芩清肺剂是根据临床应用多年的验方改良的中药浓缩袋泡茶，通过二十余年临床应用发现，其在防治急慢性支气管炎、哮喘方面具有良好疗效。目前研究发现，气道神经源性炎症与CVA的发生发展联系密切，据此，本实验拟通过卵清白蛋白（OVA）诱致大鼠CVA 模型，以观察翘芩清肺剂在CVA 中的防治作用，并初步探讨其作用机制以及与气道神经源性炎症的关联，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 大鼠共48 只，雌雄各半，平均体重约（150～180）g，自北京华阜康生物科技股份有限公司购入，合格证号：SCXK（京）2019-0008。于暨南大学实验动物管理中心进行饲养，实验单位使用许可证号：SYXK（粤）2017-0174。实验室相对湿度为40%～70%、温度（22±2）℃，明暗周期均为12 h。本实验通过暨南大学实验动物福利伦理委员会批准，批准编号：IACUC-20210824-08。

1.2 药物及试剂

卵清白蛋白（美国sigma，Lot#SLCH2414）；氢氧化铝（天津市大茂化学试剂厂，批号：20210104）；氯化钠注射液（辰欣药业股份有限公司，产品批号：2106250721）；孟鲁司特钠咀嚼片（石家庄石药集团欧意药业有限公司，国药准字H20203047）；翘芩清肺剂（下简称翘芩，广州医科大学附属中医医院的制剂室供给，2.5 kg 生药量/L）；大鼠神经生长因子ELISA 试剂盒（博士德，产品编号：EK0471）；大鼠P物质 ELISA 试剂盒（华美，产品编号：CSB-E08358r）；兔抗 NGF Polyclonal Antibody（SAB 生物技术有限公司，产品编号：41239）；兔抗SP1 Antibody（SAB 生物技术有限公司，产品编号：37251）；SABC 免疫组化试剂盒（博士德，产品编号：SA1020）；DAB 试剂盒（博士德，商品编号：AR1027）。

1.3 主要仪器

海尔压缩式医用雾化器（皖械注准20192080049，型号：YS-06），分析天平（广东华运仪生物工程有限公司，型号：BSA2202S），微样全自动五分类动物血液分析仪（美国DREW Scientific，型号：HEMAVET 950FS），酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司，型号：Multiskan Mk3）。

1.4 模型建立

根据文献报道及既往研究工作基础建立动物模型［6-9］，SD 大鼠于安静、干燥、通风的环境中适应性饲养10 d 后，再采用OVA 联合氢氧化铝［Al（OH）3］致敏并多次反复激发的方法建立大鼠CVA模型。（1）致敏阶段：各干预组和模型组大鼠在实验开始时第1 天、第3 天、第5 天、第7 天及第11 天腹腔注射+皮下注射给予10%卵清白蛋白、氢氧化铝混悬液1 mL（腹腔注射0.5 mL，余下0.5 mL 背部皮下多点注射），空白组给予等量的生理盐水进行腹腔注射。（2）激发阶段：第15 天将各干预组和模型组大鼠放置于有机的封闭玻璃箱内超声雾化来诱发哮喘，雾化浓度为1% OVA 溶液，时间30 min，每日1次哮喘激发，连续2 周。空白组大鼠雾化等量、等时间的生理盐水。以模型组大鼠出现腹肌收缩、呼吸急促、咳嗽等情况并且血液中嗜酸性粒细胞百分比显著高于空白组，从而确定模型成功（P＜0.05）。

1.5 分组、给药及取材

将48 只SD 大鼠随机分为6 组：空白组、模型组、孟鲁司特钠组和翘芩高、中、低剂量组，每组8只。从致敏第2 天开始，翘芩高、中、低剂量组分别予翘芩清肺剂26、13、6.5 g/kg 灌胃，孟鲁司特钠组给予孟鲁司特钠混悬液1.05 mg/kg 灌胃，空白组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水，每日1 次，持续干预28 d。动物连续处理4 周后，安乐死前12 h 禁食、不禁水，次晨再次予相应的受试物干预40 min 后，称取大鼠体重，予戊巴比妥钠45 mg/kg 腹腔注射进行麻醉，将其仰卧固定在手术台，腹主动脉取1 mL 血置于EDTA 抗凝管内，用于血液分析检测；暴露胸腔，每只大鼠行左肺支气管肺泡灌洗术，取生理盐水3 mL 注入气管内，并反复抽吸，提取出肺泡灌洗液（BALF），于4 ℃、4 000 r/min 下离心10 min，再取上清液，-80 ℃保存待测；迅速剥离右肺，取右肺组织，置于10% 甲醛溶液中固定，供苏木精-伊红（HE）染色和免疫组化检测应用。

1.6 HE 染色法观察肺组织的病理改变

取用10%甲醛溶液固定后的大鼠右肺上叶组织，经脱水、透明、石蜡包埋、切片后，进行HE 染色。于光学显微镜下观察各组大鼠肺组织的病理学变化。

1.7 ELISA 法测定肺泡灌洗液的NGF、SP 含量

采用双抗体夹心ABC-ELISA 法，根据NGF、SP 试剂盒的说明方法予以检测。反应终止后，在450 nm 波长处用酶标仪依次测定各孔的光密度（OD 值），以标准品的浓度及对应的OD 值，并绘制标准曲线图，再根据样品OD 值于该曲线图上计算相应的大鼠NGF、SP 的含量。

1.8 免疫组织化学法检测肺组织中NGF、SP 的蛋白表达水平

取大鼠右肺中叶组织切片，并脱蜡至水后，经过抗原修复、封闭，于37 ℃下孵育一抗1 h；孵育二抗30 min，经DAB 显色、苏木素复染和脱水封片后，在光学显微镜下观察、照相，棕黄色为阳性染色。每张片子中选取5 个区域拍摄，并采用Image-Pro Plus v6.0 病理图象分析，从而测定各组中免疫阳性产物的光密度OD 值，再取平均数，得出该动物的肺组织中NGF、SP 蛋白表达水平。

1.9 统计学处理

采用SPSS 26.0 统计软件来分析数据；连续型资料以均数±标准差（±s）表示；服从正态分布的用t检验，不服从正态分布的用Mann-WhitneyU检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘模型大鼠血液嗜酸性粒细胞数量及百分比的影响

与空白组比较，模型组大鼠血液嗜酸性粒细胞数量及百分比增加，差异有显著性（P＜0.01）。与模型组比较，孟鲁斯特钠明显降低大鼠血液嗜酸性粒细胞数量及百分比（P＜0.05），翘芩清肺剂中、低剂量组亦可降低嗜酸性粒细胞数量及百分比，可见明显统计学差异（P＜0.05）。综上，以模型组大鼠出现腹肌收缩、呼吸急促、咳嗽等情况并且血液中嗜酸性粒细胞百分比显著高于空白组，从而确定模型成功（P＜0.05）。见表1。

表1 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠血液嗜酸性粒细胞数量及百分比的影响（±s，n=8）Tab 1 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the number and percentage of blood eosinophils in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

表1 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠血液嗜酸性粒细胞数量及百分比的影响（±s，n=8）Tab 1 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the number and percentage of blood eosinophils in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

注：与空白组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

嗜酸性粒细胞百分比/(%)组别剂量/(g/kg)嗜酸性粒细胞数量/(×109/L)0.35±0.19**0.98±0.40##0.58±0.15#*0.72±0.34#0.46±0.09**0.57±0.26*5.559 0.001空白组模型组孟鲁司特钠组翘芩高剂量组翘芩中剂量组翘芩低剂量组--1.05 mg/kg 26.0 13.0 6.5 FP 0.02±0.01**0.06±0.03##0.04±0.01##*0.05±0.03##0.03±0.01#**0.03±0.01**6.908 0.000

2.2 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织病理变化的影响

空白组大鼠肺气管上皮细胞整齐排列有规则，管腔内见少量上皮细胞脱落，气管壁未见浸润的炎症细胞，肺泡未见扩张，肺泡中未见上皮细胞和炎症细胞坏死脱落，肺血管未见充血，管壁未见明显的炎症细胞浸润，肺泡壁未见增厚。与空白组比较，模型组大鼠的肺血管壁周围出现大量炎症细胞浸润，血管壁结构疏松，水肿明显，肺泡壁有些增厚，肺泡壁中出现炎症细胞浸润，肺气管中可见上皮细胞坏死脱落。各药物干预组，其中，孟鲁司特钠组大鼠肺气管有些坏死脱落的上皮细胞，气管壁中出现少量炎症细胞浸润，肺泡壁轻微增厚，泡壁中可见少许炎症细胞浸润，但肺泡未见明显扩张，血管有些轻微的充血；翘芩清肺剂组大鼠肺组织病理学改变均有不同程度的减轻，上皮细胞坏死脱落减少，气管壁周围炎症细胞浸润明显减轻，未见肺泡壁明显增厚，也未见肺泡扩张，其中又以翘芩高剂量组的改善程度最显著，翘芩中、低剂量组次之。见图1、2。

图1 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织病理变化的影响（HE 染色，×100）Fig 1 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on pathological changes of lung tissue in cough variant asthma model rats（HE staining，×100）

图2 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织病理变化的影响（HE 染色，×400）Fig 2 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on pathological changes of lung tissue in cough variant asthma model rats（HE staining，×400）

2.3 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺泡灌洗液中NGF、SP 含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠中肺泡灌洗液的NGF、SP 含量均升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，翘芩清肺剂高、中、低剂量组和孟鲁司特钠组肺泡灌洗液中的NGF、SP 含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺泡灌洗液中NGF、SP 含量的影响（±s，n=8）Tab 2 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the contents of NGF and SP in alveolar lavage solution of cough variant asthma rats（±s，n=8)

表2 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺泡灌洗液中NGF、SP 含量的影响（±s，n=8）Tab 2 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the contents of NGF and SP in alveolar lavage solution of cough variant asthma rats（±s，n=8)

注：与空白组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

SP/(pg/mL)18.76±14.07 35.64±29.63 8.41±5.48*8.23±4.05*9.08±6.48*9.40±9.87*4.535 0.002组别空白组模型组孟鲁司特钠组翘芩高剂量组翘芩中剂量组翘芩低剂量组剂量/(g/kg)--1.05 mg/kg 26.0 13.0 6.5 FP NGF/(pg/mL)7.27±3.92 10.47±6.03 2.99±1.12#*2.69±0.65#**3.10±1.18#*3.21±1.21#*8.746 0.000

2.4 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织中NGF、SP 蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组大鼠的肺组织中NGF、SP 的蛋白表达水平升高明显，差异具有显著性（P＜0.01）；与模型组相比，翘芩清肺剂高、中、低剂量组和孟鲁司特钠组肺组织中NGF、SP 的蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图3、4 及表3。

图3 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织中NGF 蛋白表达的影响（免疫组化，×400）Fig 3 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of NGF protein in lung tissue in cough variant asthma model rats（IHC，×400）

图4 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织中SP 蛋白表达的影响（免疫组化，×400）Fig 4 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of SP protein in lung tissue in cough variant asthma model rats（IHC，×400）

表3 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织中NGF、SP 蛋白表达的影响（±s，n=8）Tab 3 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of NGF and SP protein in lung tissue in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

表3 翘芩清肺剂对咳嗽变异性哮喘大鼠肺组织中NGF、SP 蛋白表达的影响（±s，n=8）Tab 3 Effects of Qiaoqin Qingfei agent on the expression of NGF and SP protein in lung tissue in cough variant asthma model rats （±s，n=8）

注：与空白组比较：#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

SP/(OD 值)0.228±0.006**0.292±0.016##0.248±0.004##**0.244±0.005##**0.261±0.007##**0.273±0.006##**61.123 0.000组别空白组模型组孟鲁司特钠组翘芩高剂量组翘芩中剂量组翘芩低剂量组剂量/(g/kg)--1.05 mg/kg 26.00 13.00 6.50 FP NGF/(OD 值)0.219±0.007**0.290±0.008##0.250±0.005##**0.235±0.004##**0.253±0.006##**0.271±0.006##**136.759 0.000

3 讨论

CVA 的发病机制复杂，是由免疫、环境、遗传等诸多因素联合影响的结果，包括气道慢性炎症、气道高反应性、气道重塑及遗传因素是其最主要的发病机理。近年，人们逐渐重视由感觉性神经末梢所分泌的神经肽调节引起的气道神经源性炎症［10］。由感觉性神经末梢分泌的速激肽而产生的各种生理学改变如微血管通透性提高、黏液分泌增多、气道平滑肌收缩、咳嗽和促进白细胞黏附等效应被称之为“气道神经源性炎症”。目前，相关研究表明，神经源性炎症可能是CVA 的一个重要发病机制，而气道神经源性炎症的出现也是咳嗽敏感性升高、干咳缠绵难愈的重要原因［11］。

NGF 是调控神经源性炎症的关键细胞因子，可通过神经和免疫系统而放大气道炎症，在气道神经源性炎症中起到重要影响［12］。有研究表明其可能参与了哮喘的气道平滑肌收缩和神经源性炎症等多种病理反应，并与气道炎症的形成、发展密切相关，从而在哮喘气道慢性炎症、气道高反应性以及气道重塑等过程中承担着重要的调控作用［13-15］。国外研究显示，NGF 可促进速激肽在神经细胞中的分泌，使速激肽受体的表达上调，诱发神经源性炎症而参与哮喘的发病机理［16］。

SP 为速激肽类神经介质中的一类，是非肾上腺素能非胆碱能神经系统释放的一种感觉神经肽，在气道炎症中可被诱导表达，并对神经源性炎症具有重要的调节作用［17］。SP 在支气管壁和肺泡壁中广泛存在，与黏液分泌增多、支气管平滑肌收缩等密切相关，可使血管通透性升高、血浆渗出、引发组织水肿等病理变化，于CVA 中体现为气道神经源性炎症［18-21］。SP 具有强大的致炎作用，可通过诱导炎症细胞浸润从而参与气道高反应性和气道炎症的形成［22］，增强血管的通透性，导致炎性渗出，趋化中性粒细胞、单核-巨噬细胞，从而加重气道炎症反应，形成恶性循环［23-25］。

祖国医学并无与CVA 完全对应的病名，但多数中医学专家都主张本病与哮喘的病因病机相类似，是“伏痰遇感而发”，属“哮咳”、“风咳”、“顽咳”、“痉咳”之类别。中医对该病的治则为固本扶正、消风止咳。翘芩清肺剂是纯中药复方制剂，我院已经临床使用多年，由连翘、黄芩、板蓝根、玄参、前胡、薄荷、荆芥、桔梗、苦杏仁、甘草等中药组成。全方清泻肺热，利咽止咳。课题组前期研究已证明了翘芩清肺剂对哮喘具有良好的预防及治疗作用［26，27］。据此，本实验拟进一步通过观察NGF、SP 这两个关键介质在CVA 大鼠肺组织中的表达，初步探讨气道神经源性炎症与CVA 发病的相关性及翘芩清肺剂是否通过调节气道神经源性炎症而防治CVA，为临床防治CVA 提供实验室依据。

据文献报道，NGF、SP 与CVA 的发病过程及气道神经源性炎症的发生有着紧密的联系，可通过调控气道神经源性炎症，参与CVA 的发病机制。本实验结果显示，与空白组相比，模型组大鼠的NGF、SP 水平显著增高，提示在CVA 状态下，NGF、SP 水平升高，证实了NGF、SP 参与了CVA的发生、发展过程，并可能通过诱导炎症细胞因子释放而加重气道炎症反应。药物组干预后显示，与模型组比较，各组肺组织的炎症反应均有不同程度减轻，NGF、SP 的蛋白表达水平和肺泡灌洗液中的NGF、SP 含量均明显降低。

国内外研究显示，MAPK 和ERK 通路均为神经源性炎症发生过程中的重要信号传导途径，其中ERK 信号通路可被NGF 活化［26］。在本实验的前期研究中，已证实翘芩清肺剂可明显降低哮喘大鼠肺组织p38 MAPK 蛋白表达和ERK1/2 mRNA 的表达，有效调节HMGB-MAPK-ERK 信号通路的传导［26，27］。由此推测翘芩清肺剂可能通过调节气道神经源性炎症中NGF、SP 的蛋白表达水平，从而介导并调控MAPK 及ERK 等炎症通路，减轻气道炎症，并减缓了咳嗽变异性哮喘的发展进程。

实验的肺组织病理结果显示，CVA 大鼠模型组肺组织已有明显炎症病理变化，NGF、SP 的蛋白表达水平明显升高，但在肺泡灌洗液的检测中却未能印证这一改变。这一结果提示CVA 是一个长期发展的慢性疾病，有时候检测的方式手段、检测部位及检测指标并不一定能及时反映病情早期的真实情况，由此更应该重视早期控制气道神经源性炎症发生发展的重要性，从而达到未病先防，减缓甚至阻断CVA 的进程，以期达到早期防治CVA 向哮喘转变的目的。

综上所述，翘芩清肺剂可有效调节肺组织中的NGF、SP 的蛋白表达水平，降低CVA 状态下异常升高的NGF、SP 水平，从而减轻了气道炎症的一系列瀑布效应，干预了气道炎症的发生与发展，从而有效地缓解咳嗽变异性哮喘，但具体的靶点仍有待进一步探讨。

作者贡献度说明：

黄慧思：实验研究、指标检测、分析数据、撰写论文；韩超、石艳红：实验设计与指导、资金获取、论文审阅；齐春丽、熊爱华：建立模型、取材、指标检测；张秋玲、梁慧玲：指标检测、资金获取。

所有作者声明不存在利益冲突关系。