应用ARFI 技术探讨肝豆汤治疗湿热内蕴型Wilson 病肝纤维化的临床研究

韩 卉，汪美霞，陶 庄，张艳云，张 宇，蒋真真，王 飞，孙 阔

（1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230038）

肝豆状核变性又称Wilson 病（Wilson's disease，WD）是一种因常染色体上的ATP7B 基因突变，导致机体铜代谢异常，进而损害全身脏器的隐性遗传性疾病，临床常见肝、脑、肾等人体器官损害［1-3］。肝纤维化是WD 患者肝损伤的重要表现。前期研究显示［4］，肝纤维化经有效治疗可以逆转。肝穿刺诊断肝纤维化属有创性检查，难以重复进行，所以无创性肝纤维化诊断技术近年较引人注目。声辐射力脉冲弹性成像（acoustic radiation force impulse，ARFI）先进行肝脏常规超声检测，通过检测选择待评价区域，可避免解剖学障碍（如血管等），是一种简便、具有可重复性的无创评价肝纤维化的方法，对肝纤维化、肝硬化有较好的诊断价值，因而ARFI技术的应用具有重要的临床意义［5，6］。

研究表明［7，8］，ARFI 所得肝脏剪切波速度（Shear wave velocity，SWV）联合APRI 评分（Aspartate Aminotransferase to Platelet Ratio Index）、FIB-4 指数（Fibrosis-4 index）及联合肝纤四项Ⅳ型胶原（type Ⅳ collagen，CⅣ）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅲ型前胶原N 端肽（type Ⅲ procollagen peptide，PⅢNP）、层黏连蛋白（laminin，LN）共同诊断可显著提高肝纤维化的诊断率。

安徽中医药大学第一附属医院脑病科作为国家中医重点专病肝豆状核变性诊疗中心，采用中医药治疗Wilson 病临床疗效显著。既往研究均表明［9，10］，GDT 具有清热解毒、通腑利湿的功效。故本研究在前期研究基础上，选取湿热内蕴型Wilson 病肝纤维化患者，动态监测SWV 水平，探讨SWV 与肝纤维化血清学指标 HA、C Ⅳ、LN、P ⅢNP 及APRI 评分、FIB-4 指数的相关性，进而反映肝纤维化程度的变化，为GDT 治疗WD 肝纤维化提供临床疗效参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集80 例2021 年8 月～2022 年8 月安徽中医药大学第一附属医院脑病科住院湿热内蕴型WD患者，根据治疗方法分为治疗组和对照组，每组40例。治疗组男性22 例，女性18 例，年龄（15～57）岁，平均（32.2±10.24）岁，平均病程（8.32±6.72）年；对照组男性20 例，女性20 例，年龄（16～55）岁，平均（31.63±9.18）岁；平均病程（8.50±5.32）年。各组一般资料之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 诊断标准

1.2.1 WD 诊断标准 参照2008 年中华医学会制定的《肝豆状核变性的诊断与治疗指南》［11］制定。

1.2.2 WD 湿热内蕴证诊断标准 参照杨文明教授《肝豆状核变性诊疗方案》［12］，WD 湿热内蕴证的诊断标准为：手足震颤，言语含糊，行走困难，肢僵挛缩，口苦口臭，口涎不止，鼻衄齿衄，黄疸水臌，腹胀痞满，尿赤，大便秘结，舌质红，苔黄腻，脉弦滑数。

1.2.3 WD 肝纤维化诊断标准 目前临床上诊断肝纤维化可进行肝活检，当肝组织病理检查纤维化程度在F2 以上，即可确诊为肝纤维化。因肝活检属于有创性检查，患者也可行ARFI 技术检测，ARFI达到肝脏纤维化硬度值，可确诊为肝纤维化［13］。

1.3 纳入标准

（1）符合 WD 西医诊断标准及中医证候分型特征；（2）同时符合肝纤维化诊断标准；（3）所有患者均为初诊或半年内未经规范排铜治疗；（4）研究对象了解研究目的，自愿参加研究并签署知情同意书（未成年患者需监护人同意并签署知情同意书）。

1.4 排除标准

（1）妊娠期及哺乳期患者；（2）合并自身免疫性肝病者；（3）合并感染类疾病、免疫性疾病者；（4）合并严重精神障碍及其他严重心、肾功能损害者；（5）无症状的WD 患者；（6）临床资料不完整者；（7）依从性不佳者。

1.5 治疗方法

1.5.1 对照组 予以二巯丙磺钠（DMPS，上海禾丰制药有限公司，国药准字H31021514）静滴。将二巯丙磺钠20 mg/kg 溶于250 mL 5%葡萄糖溶液静脉滴注，连续6 d，间歇期为2 d，间歇期每日静脉滴注20 mL 的10%葡萄糖酸钙，此8 d 为1 个疗程，共治疗6 个疗程。

1.5.2 治疗组 在对照组基础上予以肝豆汤（组方：半枝莲、黄芩、穿心莲、生大黄、黄连、萆薢），所有饮片均来自安徽中医药大学第一附属医院药剂科，并由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心制成水煎剂，每日一剂（约200 mL），早晚分服，8 d 为1个疗程，共治疗6 个疗程。

1.6 观察指标及疗效判断

（1）肝脏剪切波速度（SWV）：采用4C1 凸阵探头的彩色多普勒超声诊断仪（SIEMENS Acuson S2000），配置 ARFI 成像系统，其频率区间为 1.5～4.0 MHz。首先，嘱患者平卧位，在空腹状态下行肝脏常规超声扫查及彩色血流显像，然后，嘱患者左侧卧位，并抬高右上肢，将肝区充分暴露，将探头置于右侧腋前线至腋中线第7～9 肋间进行扫查，注意避开肝内大血管、胆管结构（如门静脉、肝动静脉及胆道系统），嘱患者屏气，启动 ARFI 成像系统，测量肝脏的剪切波速度（SWV），重复5 次，取5 次测量值的平均值。

（2）实验室检查：分别采取治疗前、后两组的外周静脉血。采用放射免疫法测定肝纤维化血清学指标：HA、LN、PC Ⅲ、C-Ⅳ（批号：20190409，20190412，20190427，20190407，郑州安图生物工程股份有限公司）。采用乳酸脱氢法检测丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST），ALT，AST 试剂盒来自贝克曼库尔特实验系统（苏州）有限公司，批号分别为AUZ9248，AUZ8788；采用固相凝固法检测血小板（PLT）（批号：A1042，希森美康株式会社）。各指标测定均严格按照试剂盒说明书提供的操作步骤进行。

（3）无创性血清指标评分：APRI 计算公式：（AST/正常值上限）×100/PLT［14］；FIB-4 指数计算公式：（年龄×AST）/（PLT×）［15］

（4）不良反应及安全性评价：监测治疗中有无引起肝功能继发损害（如ALT、AST），肾功能损害（如肌酐Cr、尿素氮BUN），有无皮肤瘙痒等过敏症状等。

1.7 统计学处理

所有数据采用SPSS 23.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示；组间治疗前后对比采用独立样本t检验；组内治疗前后对比采用配对t检验。计数资料采用卡方检验比较。相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后血清肝纤维化指标水平比较

两组治疗前HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平，具有可比性（P＞0.05），差异无统计学意义。与本组治疗前比较，治疗组与对照组 HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平均显著下降（P＜0.05）；相较于对照组，治疗组疗后HA、LN、PⅢNP 下降更为显著（P＜0.05），CⅣ水平无明显特异性变化（P＞0.05）。见表1。

表1 两组治疗前后肝纤四项指标情况比较（n=40，±s）Tab 1 Comparison of four indexes of liver fiber between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

表1 两组治疗前后肝纤四项指标情况比较（n=40，±s）Tab 1 Comparison of four indexes of liver fiber between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

注：与本组治疗前比较*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组治疗后比较 #P＜0.05。

LN（μg/mL）154.72±51.79 115.80±32.55**154.68±56.06 98.31±26.38**#组别对照组治疗组时间治疗前治疗后治疗前治疗后HA（μg/mL）164.31±98.71 116.20±69.45*166.80±62.09 90.72±37.10**#PIIINP（μg/mL）27.99±16.36 17.60±10.59**28.50±18.83 12.91±6.03**#CIV（μg/mL）107.37±68.69 75.30±54.44**106.89±74.26 64.64±44.87*

2.2 两组治疗前后SWV、APRI 及 FIB-4 评分的变化

治疗前，两组患者的SWV、APRI 及 FIB-4 评分，具有可比性（P＞0.05），差异无统计学意义；治疗后，两组SWV、APRI 及 FIB-4 评分均显著性降低，具有统计学意义（P＜0.01）。相较于对照组，治疗组FIB-4 评分明显下降（P＜0.05），SWV 及APRI 下降更为显著（P＜0.01），差异均具有统计学意义。见表2。

表2 两组患者治疗前后SWV 数值及无创血清模型（APRI 评分、FIB-4 指数）比较（n=40，±s）Tab 2 Comparison of SWV value and non-invasive serum model （APRI score and FIB-4 index）between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

表2 两组患者治疗前后SWV 数值及无创血清模型（APRI 评分、FIB-4 指数）比较（n=40，±s）Tab 2 Comparison of SWV value and non-invasive serum model （APRI score and FIB-4 index）between the two groups before and after treatment（n=40，±s）

注：与本组治疗前比较 **)P＜0.01；与对照组治疗后比较 #）P＜0.05, ##）P＜0.01。

FIB-4 2.38±0.48 1.75±0.53**2.39±0.89 1.20±0.35**#组别对照组治疗组时间治疗前治疗后治疗前治疗后SWV 1.77±1.50 1.48±1.62**1.79±1.87 1.29±0.98**##APRI 1.76±0.48 0.99±0.29**1.71±0.69 0.59±0.20**##

2.3 SWV 与血清 HA、CⅣ、LN、PⅢNP 及 APRI、FIB-4 的相关性研究

Pearson相关性检验分析，SWV 与 FIB-4（r=0.83）、APRI（r=0.82）、HA（r=0.87）、C Ⅳ（r=0.71）、LN（r=0.85）、PⅢNP（r=0.77）呈正相关（表3）。其中SWV 与HA、LN、APRI 、FIB-4 成高度相关，SWV 与CIV、PⅢNP 成中度相关。见图1、2。

图1 SWV 与 HA、CⅣ、LN、PⅢNP 的相关性分析Fig 1 Correlation analysis of SWV with HA，CIV，LN and PIIINP

图2 SWV 与 APRI、FIB-4 的相关性分析Fig 2 Correlation analysis of SWV，APRI and FIB-4

表3 SWV 与血清HA、CⅣ、LN、PⅢNP 及无创血清模型APRI、FIB-4 的相关性Tab 3 Correlation between SWV and serum HA，CIV，LN，PⅢNP and non-invasive serum model APRI，FIB-4

2.4 安全性指标

两组患者治疗前ALT、AST、BUN、Cr 水平具有可比性（P＞0.05），差异无统计学意义。与本组治疗前比较，治疗组与对照组ALT、AST 水平均显著下降（P＜0.01）；相较于对照组，治疗组疗后ALT、AST 下降更为显著（P＜0.05），而BUN、Cr 水平无明显特异性变化（P＞0.05）。见表5。

表5 两组患者治疗前后ALT、AST、BUN、Cr 数值比较（n=40，±s）Tab 5 Comparison of ALT，AST，BUN and Cr values between the two groups before and after treatment （n=40，±s）

表5 两组患者治疗前后ALT、AST、BUN、Cr 数值比较（n=40，±s）Tab 5 Comparison of ALT，AST，BUN and Cr values between the two groups before and after treatment （n=40，±s）

注：与本组治疗前比较*P＜0.01；与对照组治疗后比较#P＜0.01。

Cr(μmol/L)71.02±11.21 71.20±13.27 75.37±12.44 71.84±11.21组别对照组治疗组时间治疗前治疗后治疗前治疗后ALT(U/L)79.52±13.22 48.63±10.60*77.45±15.91 36.53±8.60*#AST(U/L)69.18±17.05 48.90±13.19*70.02±14.87 37.31±7.36*#BUN(mmol/L)5.22±1.26 4.86±1.12 5.04±1.30 5.05±0.98

2.5 药物安全性评价

所有入组并服用GDT 患者治疗后未出现明显不良反应，未出现肝肾功能加重或新发损伤表现，1例患者出现轻微皮肤瘙痒，未予特殊处理后自行缓解。

3 讨论

肝豆状核变性在中医古籍中并没有明确的记载，根据其相关临床表现，将其归属于“肝风”、“颤病”等范畴。《黄帝内经》云：“诸逆冲上，皆属于火”，“诸痉项强，皆属于湿”。本病主要由于先天禀赋不足，铜毒内生，酿生湿热，湿热铜毒蕴积于体内，瘀滞经脉所致［16］。

GDT 是我院脑病中心治疗湿热内蕴型WD 患者多年临床观察与总结所得的经验方，以清热解毒、通腑利湿为组方原则创方，组成为黄芩、大黄、黄连、半枝莲、穿心莲、萆薢。王浩泽等［17-19］研究表明，大黄素可抑制MAPK 通路及EMT，也可调控ERK/Nur77 促进Gls1 启动子甲基化，上调 Smad7、下调 α-SMA 蛋白表达，从而发挥抗肝纤维化的作用。刘世杰等［20-22］研究表明，黄芩苷可通过抑制大鼠转化生长因子β1 的表达发挥抗肝纤维化作用，亦可通过抑制相关细胞因子的表达，而起到抗肝纤维化的作用。刘国芳等［23］发现，黄芩苷可以下调肝纤维化大鼠SOCS1 水平，抑制HSC-T6 细胞增殖，从而减轻肝纤维化。欧意桃等［24］实验研究表明，黄连素抗炎、抗氧化应激的作用可有效抗肝纤维化。半枝莲中的黄酮类、二萜类等活性成分具有清热、抗炎、保肝及抗氧化等多种药理作用［25］。谢婧等［26，27］指出脱水穿心莲内酯可以下调氧化应激蛋白表达，减少肝星状细胞活化，从而发挥抗纤维化作用。另有研究表明［28，29］，肝豆汤可通过调控引起细胞程序性死亡（PCD）的ERK 通路和 MAPK 通路相关蛋白的表达，从而降低WD 肝纤维化的病理损害过程，从而促进细胞排铜，也可激活肝脏Wnt/β-catenin 信号通路，促进损伤的肝组织代偿性自愈，减轻铜对肝脏的损伤。

肝脏是WD 最早、最主要的受累器官［30］，而肝纤维化是铜代谢障碍引起的最基本的肝脏病理变化［31］。当肝细胞内大量蓄积铜离子时，肝细胞发生变性坏死，肝脏受到不同程度的损害，肝脏的硬度逐渐发生变化，由肝纤维化逐渐进展为肝硬化、肝癌。肝纤维化为可逆阶段，通过治疗可以使肝纤维化逆转，但肝硬化多难以逆转。因此，及早采取有效诊断及治疗对于逆转肝纤维化具有重要意义［32］。对于肝纤维化诊断，相比于以往有创性、易感染的肝穿刺活检，近些年来无创肝纤维化诊断方法，因其无创、不易感染、准确度高和可重复等优势，已成为临床诊断的首选［31］。ARFI 的工作原理是利用超声波束在肝组织内产生声剪切波信号，使其局部产生微小变形，并监测低频剪切波的传播速度，得到肝组织弹性分布［33］。既往研究［34］表明在肝纤维化的诊断中，ARFI 作为诊断肝纤维化程度的可靠手段，失败率更低，并可用于有肥胖及腹水的患者，可有效避开肝内血管和肋骨，并能够定量分析肝脏脂肪变性程度。临床治疗时，在治疗各时期采用ARFI 技术观察和定量分析WD 患者肝脏维化程度，可有效监测WD 患者病情、临床疗效、并对预后进行判断。此外，APRI 和 FIB-4 对于肝纤维化程度的评估也具有较高的临床应用价值［35，36］，且与肝纤四项及ARFI 合用，可提高肝纤维化、肝硬化的诊断率［7，8］。张洁媛等［37］分析102 例胆道闭锁患儿SWV 值与肝纤维化指标的相关性，发现BA 患儿的SWV 值与HA、CⅣ、LN 均呈显著的正相关性，这与本实验结果相同。说明SWV 可与肝纤维化血清指标共同反应肝纤维化程度，且剪切波速度值越高，说明肝脏纤维化程度越重。本研究结果中，治疗组SWV 值及HA、LN、PⅢNP 明显低于对照组，说明肝豆汤可以显著改善肝纤维化，提高患者生活质量。

综上，肝豆汤联合DMPS 综合驱铜保肝治疗，可显著改善WD 患者肝纤维化程度，且肝豆汤为中药汤剂，具有不良反应小，安全性高及价格低廉等优势，作为临床治疗湿热内蕴型WD 肝纤维化患者的诊疗方案值得推广。本研究的不足之处在于，样本资料较少，容量较局限，且研究时间相对较短，在统计学分析时，可能存在统计误差，故后期将进行大样本、随机、长期的研究，以减小统计学误差，提供更多数据支撑。本文重在肝脏方面研究，但WD可累及肾脏、心脏等，后期本课题组将进一步进行肾脏、心脏等方面相关研究。

作者贡献度说明：

汪美霞：设计研究思路、基金支持及论文审校；韩卉：方案实施及论文撰写；陶庄、张艳云：论文修改、文献检索；张宇：数据审校；蒋真真：数据收集；王飞、孙阔：统计分析。

所有作者声明不存在利益冲突关系。