脊髓损伤后肌肉萎缩lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络的筛选及验证

刘付春，李筱璐，刘青青，桂裕昌，张寅炜，许建文

（1.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001；2.广西医科大学第一附属医院康复医学科，广西 南宁 530000）

SCI是指脊髓受到直接或间接暴力，引起损伤平面及以下的神经支配区域出现运动、感觉功能障碍的一种神经系统疾病。甚至对患者生命造成巨大的威胁，目前尚缺乏有效的治疗手段。据一项Meta 分析显示，每100 万人中就约有22.55 万人发生SCI，男性的发病率远高于女性，其中又以青壮年人群为主，导致患者劳动力丧失，不仅给患者家庭带来巨额的治疗费用及严重的生理负担，也对社会造成了巨大的经济损失［1，2］。SCI 后骨骼肌由于失去神经支配、营养，肌肉长时间失用，导致肌肉萎缩，对患者的康复及生活质量造成巨大的影响。虽然有证据表明，电刺激［3，4］、运动训练［5，6］等手段具有一定的治疗作用，但是效果仍不尽人意，且SCI 后肌肉萎缩的发生机制尚未清楚，是SCI 患者康复待解决的一大难题。近年来，生物信息学被广泛运用于挖掘高通量测序数据的有价值基因，可为研究者提供一定的理论依据及研究方向，据此有目的性、针对性地去挑选有研究价值的基因，有望节约大量的科研时间及精力［7，8］。GSE21497是一个研究SCI后第5 天对比第2 天病人骨骼肌基因表达谱的数据集，在本研究中，从GEO 数据库下载了该数据集，对数据集里的lncRNAs和mRNAs进行了差异表达分析，构建lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络，并对网络中的关键基因进行了实验验证，旨在为SCI 后肌肉萎缩的诊断及治疗提供一定的理论依据及靶点选择。

1 材料与方法

1.1 基因芯片

GSE21497 来源于GEO （gene expression omnibus，https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/）数据库，其基因测序平台为GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，该数据库采用自身对照的方法分别在患者发生SCI 后的第2 天和第5 天取样，共收集了10 例（9 男1 女，平均年龄44 岁，其中6 例为四肢瘫痪、4 例为截瘫）SCI患者的股外侧肌肌肉活检样本。

1.2 数据处理及差异表达基因筛选

利用R 软件（R.4.2.0）对数据进行处理，通过exprs 函数获取表达矩阵，使用Affy 包对原始数据进行质量控制、背景校正及标准化预处理。根据平台的注释信息，对探针进行基因标记注释。对杂交到相同探针上的基因进行标准化处理，剔除多余的探针。使用Limma 包对差异表达mRNAs（differentially expressed mRNAs，DEmRNAs）和差异表达lncRNAs（DElncRNAs）进行筛选，筛选条件为P＜0.05 且|logFC|＞0.585。最后，使用pheatmap 包绘制 DEmRNAs 和DElncRNAs 的火山图及热图。

1.3 加权基因共表达网络分析

对DEmRNAs 进行加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA），分析每对基因之间的Pearson 相关性，生成关系矩阵；根据无标度拓扑拟合指数（R2）值和平均连接度，确定最佳软阈值（β），由此构建WGCNA。然后，使用以下方法确定与疾病进展相关的关键模块。首先，根据基因间的高拓扑重叠度将相似基因合并，构建多个基因模块，并根据模块间的协同表达情况对基因模块进行聚类，合并相似度较高的模块；然后对每个模块的特征向量基因与疾病进展进行相关性分析（每个模块中基因表达与疾病进展之间相关性的绝对平均值被视为模块与疾病进展之间的相关性）。

1.4 lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络的构建

首先，使用miRcode 数据库预测与DElncRNAs相互作用的miRNAs，以获得lncRNA-miRNA 相互作用关系；然后，使用miRWalk、Targetscan 和miRDB 数据库预测miRNA 的靶基因（binding 概率：0.95；结合位点位置：3'-UTR）。然后，将预测的mRNA 与关键共表达模块内的基因匹配得到关键mRNA，确定miRNA-mRNA 相互作用关系。最后，使用Cytoscape 3.8 软件构建lncRNA -miRNA -mRNA 调控网络，并将结果作图展示。

1.5 功能富集分析

基于上述分析，确定关键mRNA 后，将关键mRNA 作为功能和通路富集分析的候选基因。利用 DAVID 在线数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行 GO （gene ontology）和KEGG （kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路富集分析。GO 从生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 个方面注释差异基因的功能。

1.6 关键调控网络实验验证

1.6.1 关键调控网络筛选 从1.4 构建的lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络中，通过查阅文献进一步筛选，挑选关键调控网络进行实验验证。

1.6.2 实验动物 健康SPF 级成年SD 大鼠8 只，雌性，体重（200±20）g，均购于广西医科大学实验动物中心［生产许可：SYXK（桂）2020-0004］，饲养于25 ℃，光/暗：12/12 h。

1.6.3 动物模型制备 采用随机数字法进行分组，观察组4 只，对照组4 只。使用戊巴比妥钠（浓度：3%，30 mg/kg）进行实验动物麻醉，采用经典Allen's 打击法进行SCI 模型制备（打击棒：10 g，打击棒直径：2.5 mm，打击高度：5 cm），术后连续3 天给予腹腔注射青霉素以预防感染，并每天手动按摩大鼠腹部，辅助其排尿、排便。对照组仅暴露脊髓，不进行打击。该实验方案已得到广西医科大学动物实验伦理委员会批准。

1.6.4 取材及RNA 提取 造模后7 d，给予过量麻药至使老鼠安乐死，后立即采取生理盐水进行心脏灌注，并在冰上对大鼠的股二头肌进行取材。取材完成后使用PBS 缓冲液冲洗3 遍，用滤纸吸取残留在表面的液体后置于干净的研磨管中，并使用无菌剪刀尽量把肌肉组织剪碎，加入研磨磁珠、Nucleo-Zol RNA 试剂（macherey-nagel，germany）进行充分研磨，然后按照NucleoZol RNA 试剂说明书完成总RNA 提取。

1.6.5 实时荧光定量PCR 检测 把总RNA 反转录成cDNA（Takara，RR047A 和RR036A，Japan），然后使用7500 荧光定量PCR 仪进行cDNA 扩增，其中miRNA 使用的内参基因为U6，mRNA 则为GAPDH，使用的基因引物序列见表1，荧光定量试剂盒为TB Green Premix Ex Taq II（RR820A，Japan），cDNA 相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

表1 AgNPs 的制备途径Tab 1 Preparation route of AgNPs and their advantages and disadvantages

1.7 统计学处理

本研究将利用SPSS Statistics 17 软件进行统计分析，统计方法为独立样本t检验，当t＜0.05 时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因

经P＜0.05 且|logFC|＞0.585 筛选后，共得到SCI 后第5 天的差异表达基因1 405 个，其中lncRNA 262 个、mRNA 1 143 个，筛选结果以火山图、热图展示，详见图1A-D。

图1 SCI 肌肉萎缩的差异表达基因火山图和热图Fig 1 Volcano plot，and heat map of differentially expressed genes of SCI muscle atrophy

2.2 WGCNA

利用WGCNA 对DEmRNA 进行分析，首先对软阈值（β）进行筛选，当β 为7 时具有较好的连接关系（图2）。然后对基因进行模块化分析，构建WGCNA 网络分层聚类树和共表达模块，最终得到4 个主要基因模块（turquoise、blue、brown、grey），其中turquoise 模块-特征性相关系数评分最高达0.89（图3）。

图2 无尺度网络软阈值（β）的筛选Fig 2 Screening of a soft threshold （β）of a scale-free network

图3 WGCNA 网络分层聚类树和共表达模块Fig 3 Hierarchical clustering tree and co-expression module of the WGCNA network

2.3 lncRNA-miRNA-mRNA 网络的构建

根据miRcode 数据库预测的miRNA 共211 个，通过miRWalk 、Targetscan 和miRDB 数据库预测的mRNA 共4 922 个，然后把预测出来的mRNA 与turquoise 模块里的基因取交集，共得到30 个关键mRNA（图4），再根据lncRNA-miRNA 相互作用对和 miRNA-mRNA 相 互 作 用 对 构 建lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络，最后的结果通过Cytoscape 3.8 进行可视化（图5），并通过查阅文献 ，最 终 选 择 4 条（LINC00410/miR-17-5p/KCNK10、LINC00410/miR-17-5p/PCDHA3、LIN C00410/miR-20b-5p/KCNK10、LINC00410/miR -20b-5p/PCDHA3）调控网络进行实验验证（验证了miR-17-5p、3miR-20b-5p、KCNK10、PCDHA 4个基因）。

图4 关键mRNAFig 4 Key mRNA

图5 lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络Fig 5 lncRNA-miRNA-mRNA regulatory network

2.4 功能富集分析

把2.3 里得到的30 个交集mRNA 利用DAVID在线数据库进行GO、KEGG 信号通路富集分析，分别取BP、CC、MF 排名前10 的结果及KEGG 通路富集结果绘图展示（图6）。

图6 GO、KEGG 富集分析Fig 6 GO and KEGG enrichment analyses

2.5 RT-qPCR 检测结果

相对于对照组，观察组模鼠股二头肌肌肉组织的miR-17-5p（t=0.002 038）、miR-20b-5p（t= 0.000 535）表达量升高，而KCNK10 mRNA（t=2.074 3E-7）、PCDHA3 mRNA（t=2.137 8E-8）的表达量降低（图7）。

图7 关键基因RT-qPCR 结果Fig 7 RT-qPCR results of key genes

3 讨论

SCI 作为一种严重的神经系统疾病，严重危害着患者的生命，且SCI 后并发的一系列症状也严重影响着患者的生存质量，而目前尚未找到有效的治疗手段。SCI 后由于神经损伤，不能支配和营养肌肉，导致肌肉萎缩，肌肉萎缩又进一步加重运动功能的损害，导致该区域的神经、肌肉不能得到及时有效的营养，形成恶性循环，导致肌肉萎缩进一步加重。因此探讨SCI 后肌肉萎缩的病理机制及治疗手段具有重大的研究意义。严重的SCI 会导致神经信号传导途径受损、运动神经元萎缩、神经肌肉接头的病理变化，从而引起肌纤维生成能力减弱，肌肉萎缩、运动功能障碍［9，10］。对比大多数的废用性肌肉萎缩，SCI 后肌肉萎缩的信号及模式可能更加严重，肌肉萎缩的速度也更快。虽然萎缩信号在严重SCI 后导致肌纤维丢失，但合成代谢信号的减少可能是导致肌肉持续缺失的原因之一［11］。IGF-1/PI3K/Akt 信号通路的下游蛋白雷帕霉素（mTOR）是参与合成代谢的关键蛋白，mTOR 发生磷酸化，就会靶向启动其下游参与翻译的蛋白，从而增加蛋白质的合成，如果该途径能持续激活，就有可能逆转肌肉萎缩［12］。研究证明，SCI 后肌纤维含量减少，磷酸化的PI3K、AKT、mTOR 表达含量下降，这可能是SCI 患者持续长时间蛋白质合成减少、肌肉萎缩的原因之一［13-15］。有报道显示，SCI 创伤或随后的手术干预会导致患者产生较为剧烈的炎症反应，加剧肌肉萎缩，而使用大剂量的糖皮质激素在急性、亚急性期能够抑制SCI 后继发性损伤的炎症反应［16，17］。相反的，亦有研究显示，大剂量的甲基强的松龙增加了FOXO1、MAFbx、MuRF1 和Redd1 的表达，而这些蛋白的表达将会抑制mTOR 的磷酸化，减少蛋白质的合成，导致肌纤维丢失［18］。虽然目前对SCI 后肌肉萎缩已有不少相关研究报道，但相关肌肉萎缩和合成代谢信号模式仍未明确，也缺乏有效的治疗手段。本研究从分子机制水平上探讨了SCI 后肌肉萎缩的病理机制，为进一步探寻更有效的治疗手段提供一定的理论依据。

本研究应用生物信息学分析对SCI 后第2 d 和第5 d 的股外侧肌活检进行基因表达图谱差异分析，并构建了lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络，筛选出关键调控基因，并利用大鼠进行了RT-qPCR实验验证，为SCI 肌肉萎缩的治疗提供新的靶点及方向。

GO 富集分析显示，发现关键mRNA 主要参与了树突、神经元胞体、神经元细胞核周体、细胞膜、核膜、质膜等细胞成分的调节，说明其与SCI 后的神经元重塑、信号传递息息相关；在分子功能水平主要参与调节蛋白激酶、连接酶、跨膜转运蛋白及受体的活性，参与肌动蛋白的结合，提示其与肌细胞的合成及信号传递可能密切相关；在生物过程层面，主要参与了细胞的增殖、血管生成、氨基酸转运、一氧化氮合酶合成的正向调控、PI3K 信号的正向调控，提示其可能与细胞的增殖、促进细胞自噬及抑制凋亡密切相关，从而有助于神经元的恢复。总而言之，GO 富集分析提示，关键mRNA 可能主要是通过影响神经元的生成、信号传递来影响SCI 后发生的肌肉萎缩。

KEGG 通路富集分析显示，关键基因主要参与缺氧诱导因子（HIF-1）信号通路和肿瘤中的程序性死亡配体1（PD-L1）表达和程序性死亡蛋白1（PD-1）检查点通路的调控。HIF-1 是一种转录因子，由HIF-1α 和HIF-1β 两个亚基组成，在O2充足的条件下，脯氨酸残基402 和/或脯氨酸残基-564 利用O2和α-酮戊二酸作为底物通过脯氨酸羟化酶结构域蛋白2 羟化HIF-1α，导致E3 泛素化，引起蛋白酶体亚基降解。相反，在缺氧条件下，HIF-1α 与p300/ CBP 结合，充当许多缺氧诱导基因的主调节因子。研究表明，铁死亡在SCI 中具有重要的作用，而HIF-1 信号通路里的5 个基因（Stat3、Tlr4、Hmox1、Hif1α 和Cybb）在铁死亡里具有重要调控作用［19］。蛋白质脱乙酰化在SCI 继发性损伤中扮演着重要角色，会进一步加重SCI，而三乙酸甘油可能通过HIF-1 信号通路促进蛋白质乙酰化，抑制神经元炎症反应、凋亡［20］；同样的，其他研究亦表示HIF-1 信号通路在SCI 后继发性损伤具有重大意义［21，22］，提示该通路有可能成为SCI 及肌肉萎缩治疗的新靶点。PD-1 是一种免疫抑制分子，PD-1 及其配体PD-L1 可以通过调节T 细胞和B 细胞对人体细胞的反应程度，以及通过抑制T 细胞炎症反应来维持生物体对免疫系统的自我耐受性。研究显示，PD-1 和PD-L1 在SCI 后小胶质细胞上显著表达，在炎性过程中具有重要意义，敲低PD-1 表达会加剧SCI 后的炎症反应［23，24］；右美托咪定可通过上调PD-1 表达减轻神经炎症［25］，提示该通路可能主要是通过调节神经元的炎症来影响SCI 进程。综上，一些关键mRNA 可能是通过HIF-1 信号通路和PD-L1 表达和PD-1 检查点通路来影响神经元细胞的炎症反应而参与SCI 后肌肉萎缩的发生，这些机制可为SCI后肌肉萎缩的治疗研究提供了新的方向及目标。

本研究利用DEmRNA、DElnRNA 和结合miRcode、miRWalk 、Targetscan 及miRDB 数据库预测构建了lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络，进一步查阅文献后，最终筛选出4 个关键调控网络进行了实验验证，结果显示相对于对照组，观察组的miR-17-5p、miR-20b-5p 表达量升高，KCNK10、PCDHA3 表达量降低，与生物信息学预测的结果一致。既往研究表明，SCI 后miR-17-5p 表达水平上调，合成miR-17-5p 模拟物能够挽救Dicer1-null 星形胶质细胞的增殖缺陷，而miR-17-5p 的抑制剂能够阻断脂多糖诱导的星形胶质细胞增殖，其引发反应性星形胶质细胞增殖可能是通过JAK / STAT3途径来调控［26］；间充质干细胞（MSCs）能够缓解SCI，是SCI 治疗的研究热点之一，Yue 等［27］研究发现，VEGF-A mRNA 能与miR-17-5p 特异性结合，敲低VEGF-A 后，SCI 小鼠的脊髓完整组织减少，而敲低miR-17-5p 则显示出相反的结果，表明抑制miR-17-5p 的表达可以上调MSCs 中VEGF-A 的表达，促进MSCs 对脊髓损伤的修复；Zhang 等［28］发现下调miR-17-5p 表达会促进神经元轴突的生长，而STAT3 磷酸化抑制剂AG490 会逆转这种促进，验证了miR-17-5p 可以通过靶向STAT3 / GAP-43 途径调节皮质神经元轴突生长，表明miR-17-5p 在神经元轴突的生长中起关键的调控作用。在本研究中，观察组的miR-17-5p 表达量上调，与其他学者相关报道一致，提示SCI 后肌肉萎缩可能与神经的功能障碍、轴突生长异常有关。Wang 等［29］通过生物信息学分析后认为miR-20b-5p 可能是SCI 患者的潜在生物标志物；研究表明，miR-20b-5p 能够通过与淀粉样蛋白β 前体蛋白（APP）相结合达到干扰钙稳态、神经轴突生长的作用，这在神经系统疾病中具有重要意义［30］；同样的，另一项研究表明，抑制miR-20b-5p 表达，可靶向调节RhoC，减弱PC12 细胞中Aβ25-35 诱导的细胞凋亡，在神经细胞的凋亡调控中发挥着重要作用［31］。在本研究中，miR-20b-5p 表达量上调，与相关研究报道一致，提示SIC 后的肌肉萎缩可能与神经细胞的凋亡相关。KCNK10 是串联孔域钾通道家族的成员，在稳定负静息膜电位和平衡去极化方面起着重要作用。Haenisch 等［32］发现，KCNK10 是miRNA-187-3p 的靶基因，miRNA-187-3p 能够负调控KCNK10 的表达，KCNK10 表达上调具有保护作用，能够对星形胶质细胞钾和谷氨酸稳态产生有益影响；同样的Zhao 等［33］发现异氟醚预处理对缺血再灌注损伤的神经保护作用与KCNK10 通道激活的增加有关。在本实验中，KCNK10 表达量下调，可能是神经出现损伤后，KCNK10 通道激活不足，导致神经损伤不能及时控制，从而加重疾病程度。PCDHA3 是原钙粘蛋白α 基因簇的成员，是一种类似于B 细胞和T 细胞受体基因簇的不寻常基因组结构，很有可能在大脑中特定细胞-细胞连接的建立和功能以及神经元细胞黏附起关键作用［34，35］。在此次实验中，PCDHA3 表达下调，提示肌肉萎缩可能与细胞间的连接构建功能障碍有关。综上，miR-17-5p、miR-20b-5p、KCNK10、PCDHA3 等调控、表达方面的研究，可能是SCI 后肌肉萎缩相关机制值得深入探讨的方向之一。

综上所述，在SCI 后肌肉组织中发现miR-17-5p、miR-20b-5p、KCNK10、PCDHA3 存在显著的差异表达，提示这些基因可能是SCI 后肌肉萎缩的关键基因，有望为SCI 后肌肉萎缩的诊疗及康复提供新的研究靶点及方向。但该研究仍存在一定的局限性。首先，由于目前GEO 数据库上对于SCI 后肌肉萎缩的数据相对较少，样本量有限，研究结果可能具有一定的偏倚；其次，构建的SCI 后肌肉萎缩lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络缺乏有效的证据证明调控网络间的调控关系，需要进一步进行双荧光素酶、pull down 等技术开展相关实验以进一步验证lncRNA-miRNA-mRNA 调控模式的体内外生物学机制；再者，由于lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络里面的lncRNA 都是人源的，在鼠源上没有找到相应的基因序列，未能验证其表达变化是否跟生物信息学预测的一致。但总的来说，此次实验为进一步探讨SCI 后肌肉萎缩的作用机制及治疗靶点提供了一定的参考方向。

作者贡献度说明：

刘付春：论文撰写、实验设计及数据分析，许建文：参与指导、修改论文，李筱璐、刘青青：部分数据整理、图表制作，张寅伟、桂裕昌：动物造模、取材。

所有作者声明不存在利益冲突关系。