纳米银敷料治疗糖尿病足溃疡的疗效与安全的研究进展

王徐红，柳国斌，徐 磊

（上海中医药大学附属曙光医院外七科，上海 201203）

糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者最严重的慢性并发症之一［1］。它是由血管病变和（或）神经病变、感染等因素引起足部组织破坏所致。超过15%的糖尿病患者最终会发生足部溃疡，其中超过50%会出现溃疡创面感染，严重者会导致截肢［1］。最新研究［2］显示，DFU 合并感染者的截肢率是未合并感染者的50～150 倍。因此，控制感染对于保肢具有重要意义。抗生素对于控制伴有发热的全身感染疗效显著，但DFU 患者往往伴有下肢动脉病变，使局部病灶的药物浓度较低，加之耐药菌株的出现，这些都为创面感染的控制增加了困难。随着新技术、新材料日新月异的发展，越来越多的抗菌敷料走进人们的视野。其中，纳米银（通常指直径在10～100 nm）敷料以其独特的抗菌性能引起了人们的关注。当下，国内外开展纳米银敷料治疗DFU 的研究越来越多［3，4］。本文就其促进DFU 创面愈合的原理、疗效及安全性作一综述。

1 纳米银敷料促进DFU 创面愈合的原理

1.1 银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs）的制备途径

纳米银敷料采用纳米技术使AgNPs 均匀牢固地附着在敷料上，使其与创面接触后可持续不断地释放出银离子，从而达到持久的抗菌效果。AgNPs可以通过物理、化学和生物途径制备［5］。表1 列出了这3 种途径的常用方法和各自的优缺点。

表1 AgNPs 的制备途径Tab 1 Preparation route of AgNPs

1.2 AgNPs 的抗菌机制

AgNPs 因对各种病原体包括细菌、真菌和病毒的显著抗菌特性而闻名。然而，AgNPs 杀菌作用的机制尚不清楚。有学者认为，AgNPs 的杀伤作用与其纳米颗粒直接接触细菌细胞壁，然后穿透进入细胞质有关［5］。在细菌细胞壁上直接接触大比表面积的AgNPs 会导致细胞膜损伤，使细胞内容物泄漏，最终导致细胞死亡［6-9］，特别是直径＜10 nm 的Ag-NPs 对细菌的毒性更强［8］。穿透细胞质的AgNPs可能与生物分子，如蛋白质，脂质和DNA 相互作用。在某些情况下，AgNPs 可以与呼吸酶系统相互作用，从而产生活性氧（ROS），如过氧化氢（H2O2）、羟基（-OH）和超氧自由基（O2-），诱导氧化应激和损伤蛋白质和核酸［10］。

相反，AgNPs 对细菌的细胞毒作用也可能是AgNPs 氧化溶解的Ag+所致。AgNPs 暴露于气-水溶液中可被氧化生成Ag+［11］。Xiu 等［12］证明了Ag-NPs 在有氧条件下释放的银离子对抗菌活性起着完全的作用［12］。在有氧条件下，较小的AgNPs（约5 nm）比较大的AgNPs（11 nm）能释放更多的Ag+。而在厌氧环境中，很少有Ag+被释放，所以他认为，AgNPs 本身对细菌无毒。Ag+的抗菌作用和其与巯基（-SH）的相互作用密切相关［13］。因此，Ag+可以与细胞壁结合酶和蛋白质的-SH 基团发生反应，从而破坏细菌的细胞壁和干扰细菌的呼吸链。此外，AgNPs 释放的Ag+可以穿透细胞壁进入细胞质，从而降解染色体DNA［14］，或与细胞质中的蛋白质硫醇基团发生反应，从而导致DNA 失去复制能力和ATP 生成所必需的蛋白质也失去活性。一般来说，较小的银颗粒比较大的银颗粒更容易进入细胞质［15］。AgNPs 进入细胞后也能释放Ag+，从而产生自由基和氧化应激。

Bondarenko 等［16］报道了以上两种抗菌活性机制之间存在协同效应。细胞与纳米颗粒直接接触可促进Ag+从AgNPs 中释放，从而提高细胞对颗粒相关的Ag+的摄取量。Ivask 等［17］研究发现，AgNPs释放的正电荷离子往往会干扰大肠杆菌电子传递链的正常功能，从而促进活性氧（ROS）的形成。而ROS 的产生是细菌死亡的主要原因，因为它促进脂质过氧化，抑制ATP 的生成和DNA 的复制［18］。所以，这些机制效应可以总结为：AgNPs 或Ag+最初附着在细菌细胞壁上，随后穿透进入细胞内，然后导致ROS 和自由基的产生、DNA 损伤和蛋白质变性。

1.3 AgNPs 抗菌效果的影响因素

AgNPs 的抗菌效果与病原菌种类有关。由于细菌的细胞壁结构不同——革兰氏阳性菌（G+）的细胞壁非常厚，包含许多肽聚糖层，而革兰氏阴性菌（G-）只有单一的肽聚糖层，因此G-菌通常比G+菌更容易受到Ag+的侵袭。

再者，AgNPs 的杀菌效果也取决于纳米粒子的特性，包括尺寸、形状、表面电荷、剂量和粒子分散状态［19-21］。一般来说，在生理溶液中分散良好的Ag-NPs 比聚集的AgNPs 具有更强的杀菌效果。Ag-NPs 对G-菌和G+菌的杀灭效果随粒径减小而增大。如Agnihotri 等［19］合成了5、7、10、15、20、30、50、63、85 和100 nm 大小的AgNPs，并发现10 nm 以下的AgNPs 比较大的纳米颗粒对大肠杆菌的抗菌活性最好。

另外，AgNPs 具有形状依赖性的杀菌活性。Pal 等从纸片扩散试验中发现，AgNPs 对107CFU/mL 大肠杆菌的杀菌效果依次为：截断三角形＞球形＞棒状［22］。最近，Kidd 等［23］研究了球形和棒状AgNPs 对肺炎克雷伯菌的效果，结果表明，球形Ag-NPs 比杆状的对克雷伯氏菌的杀灭效果更好，且二者的杀菌活性与剂量和时间有关。

从文献来看，Ag+的正电荷对其杀菌活性也是至关重要的。它通过与带负电的细菌细胞壁之间的静电吸引进行杀菌［24］。与G+菌细胞壁的厚肽聚糖层相关的羧基、磷酸基、羟基和胺基使它们带负电荷。同样，外膜中与脂多糖相关的官能团给G-菌细胞壁带来整体负电荷［25］。此外，AgNPs 的杀菌效果也受其表面电荷的影响。如Abbaszadegan等［26］研究AgNPs 表面电荷对G+菌（金黄色葡萄球菌、突变链球菌和化脓性链球菌）和G-菌（大肠杆菌和寻常变形杆菌）抗菌活性的影响后指出，带正电荷的AgNPs 对所有菌株都表现出最高的杀菌活性，而带负电荷的抗菌活性最低，中性的抗菌活性中等。

2 纳米银敷料促进DFU 创面愈合的疗效与应用

由于AgNPs 独特的理化特性，特别是其比表面积，可能更具有优势。事实上，从直径＜20 nm 的AgNPs 中释放的Ag+比从直径更大的释放的Ag+要高出100 倍以上［27］。因为银可以产生抗菌［28］和抗炎［29］的特性，所以AgNPs 作为一种内在的治疗剂，可以促进慢性伤口的愈合。又因其抗菌谱广泛，因此其有望在促进糖尿病患者伤口愈合方面能发挥极好的潜力［30-32］。如Appapalam 等［33］报道，AgNPs可对DFU 主要的多重耐药细菌的分离株，如铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有杀菌抑制作用，并能促进创面愈合。Gohar 等从40 名DFU 患者中分离出65 株细菌，其中金黄色葡萄球菌（37%）和铜绿假单胞菌（18.5%）是溃疡样本中的主要分离株。他们研究发现，壳聚糖AgNPs与阿米卡星混合时显示出最大的抗耐药细菌活性。同时，AgNPs 可使阿米卡星最低抑菌浓度值降低95%［34］。这些研究均提示，AgNPs 对多重耐药细菌有突出疗效。

其次，纳米银敷料在促进DFU 创面愈合方面，较之于传统敷料有着显著优势。在Essa 等［35］开展的一项前瞻性、双盲、随机、对照研究中，80 名非缺血性DFU 患者被分为两组。A 组采用AgNPs 凝胶敷料治疗，B 组采用常规敷料（含或不含聚维酮碘的湿敷料）治疗，疗程为12 周。结果显示A 组的每周治愈率均明显高于常规组。另外，该敷料还有减少换药次数，减轻创面疼痛等优势。

此外，新的成分也可以被加入到AgNPs 中，组成了新型的复合材料，从而赋予其更加全面的治疗效果。如El-Batal 等［36］用伽马射线照射构建的双金属银-金纳米粒子（Ag-Au NPs），与对照组相比，对从DFU 患者中分离的抗枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和热带念珠菌等菌株都表现出最高的抗菌性能，并能抑制其生物膜的形成。Lee 等［37］合成的新型银和纳米颗粒包裹的生长因子共载壳聚糖复合水凝胶具有持续的抗微生物特性，并能促进糖尿病伤口愈合。

3 纳米银敷料用于创面安全性评价

3.1 AgNPs 的细胞毒性

许多体外模型被用以研究AgNPs 可能导致的潜在细胞毒性效应。Ag+对真核细胞的毒性反映了它们杀死微生物的方式——主要通过损害蛋白质硫醇（-SH）和产生ROS。真核生物产生ROS 的净效应是广泛和多样的，可能导致细胞膜、蛋白质和DNA 的氧化损伤，其净效应是细胞凋亡［38］。

细胞主要通过胞饮、内吞作用，少部分经过细胞膜扩散使AgNPs 进入细胞。一旦在细胞质中游离，AgNPs 就有可能通过多种途径引发氧化损伤。如从纳米颗粒表面溶解的Ag+可通过与H2O2的相互作用，导致羟基自由基（·OH）的产生；AgNPs 也可以直接与NAPDH 氧化酶或线粒体呼吸链的相互作用，从而产生ROS［39］。

另外，AgNPs 已被证明以线粒体为靶点，通过破坏呼吸链影响ATP 的产生，导致ROS 的进一步产生和释放［40］。研究表明，线粒体损伤后释放Ca2+和细胞色素c（凋亡途径的中间产物）。后者释放到细胞质室可导致“caspase 级联”的启动，其净效应是细胞凋亡［41］。再者，细胞内钙水平的升高也可能影响Ca2+/钙调素依赖的酶，导致细胞坏死。

有研究表明将人肺成纤维细胞和人胶质母细胞瘤细胞暴露在浓度高达400 μg/mL 的AgNPs 下，观察到ROS 的产生增加，ATP 的生成减少［42］。他们还注意到AgNPs 在细胞质、核内体、线粒体和细胞核均有分布，并确定AgNPs 导致的DNA 损伤具有浓度依赖的遗传毒性，而ROS 也可间接导致遗传毒性。

3.2 银在体内的分布

由于伦理和检测技术等原因，目前尚没有文献报道创面局部外用纳米银敷料后银离子在人体内的分布、代谢等情况。陈丹丹等［43］开展的一项动物试验或许可以为我们提供这方面的认识。作者按体重将0.33 g/kg 纳米银或微米银植入大鼠背部皮下组织，12 周后测定了大鼠不同脏器中的银含量，结果发现银在脾、肾、肝、脑、睾丸中蓄积的浓度较高，且纳米银在各脏器中的蓄积浓度远高于微米银，最多可达到61.9 倍［43］。

此外，Walker 等［44］分析了使用含银的伤口敷料后，银离子在人体的可能分布：（1）释放的银离子被创面局部、周围的细胞外基质蛋白或可溶性蛋白迅速结合；（2）结合可溶性蛋白的银可能被系统吸收，并通过循环系统转运到远处的器官；（3）被结合的银可能被进一步代谢：通过皮肤的正常组织更替、粪便或尿液排出体外，或矿化并以惰性、不溶性硒化物和硫化物的形式留在体内。但作者强调，正常使用含银敷料对局部和系统造成的短期和长期毒性的风险是很低的，可以忽略不计。

3.3 剂量问题

目前，绝大多数致力于AgNPs 效果的研究都是在体外进行的，而试验选择的剂量都普遍较高。事实上，纳米银的许多潜在的生物学效应很可能只有在高浓度时才会发生，而伤口敷料的含银浓度往往较低。因此，在许多情况下，毒性研究的结果与现实创面暴露的相关性并不明确［38］。其次，在任何体外研究中，引入模型系统的剂量与细胞可用的剂量之间也可能存在差异。当试图用体外系统的结果来推断其在体内系统的作用时，考虑到生理和代谢对整个生物体的影响，这就更加复杂了［38］。

或许，Cha 等［45］研究所使用的AgNPs 浓度能更好地反应其对体内细胞毒性的影响。研究者将人肝癌细胞置于浓度为2.4 μg/mL、直径为15 nm 的AgNPs 中，发现细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）的水平和线粒体的功能未受干扰，但确实观察到了DNA损伤。

可能与AgNPs 皮肤暴露最相关的研究是Arora等［46］的工作，他们研究了7～20 nm AgNPs 对小鼠原发成纤维细胞和肝细胞的影响，并观察到GSH 的降低和超氧化物歧化酶（SOD）水平的升高。因此，作者推测，在较低浓度的银（纤维母细胞为25 μg/mL，肝细胞为100 μg/mL）时，细胞的抗氧化保护机制增强。值得注意的是，无毒的浓度范围与纳米银敷料局部应用的浓度范围相当，这为该敷料的安全性提供了证据［46］.

此外，当比较AgNPs 毒性和作用模式时，还需要考虑不同批次颗粒的特性。Ahamed 等［47］比较了多糖包被和未包被银纳米颗粒的作用，得出的结论是包被的AgNPs 比未包被的对DNA 的损伤程度更大，两种类型的AgNPs 可能经历不同的胞内分布模式。

4 总结和展望

DFU 伴感染是创面经久难愈，甚至截肢的重要原因之一。而随着抗菌药物耐药问题的日益严重，寻求替代抗菌药物的压力也越来越大。AgNPs 因其独特的理化性质和抗菌特性，已被证明在DFU 治疗中非常有效［3］。银用于抗感染已有悠久的历史，但至今仍未见大规模的耐药，这与抗生素广泛性耐药形成鲜明对比。因此，该敷料值得在治疗DFU 方面推广应用。

关于AgNPs 在人体吸收、分布、代谢和排泄等具体过程，我们尚不清楚。如：细胞从受伤皮肤中摄取AgNPs 的机制和程度的问题？AgNPs 能否被转移到全身部位，进入大脑或穿过胎盘，它们如何从体内清除？在细胞内是否会侵害DNA 并造成遗传损伤的能力？与潜在毒性相关的AgNPs 表面特征是什么？等等。然而，这些问题并不意味着在DFU 治疗中使用此类敷料可能存在安全问题。但这或许是研究者未来探索的方向。目前，能做的可能是摸索治疗各类慢性溃疡，包括DFU 能够取得最佳疗效和安全性的合适剂量。

AgNPs 在杀伤抑制感染创面微生物的同时，对人体的正常细胞也会有一定的细胞毒性作用，可引起正常细胞的凋亡。但临床尚未见其明显毒性反应。因此，笔者认为其收益/风险比是有利的，特别是对于出现耐药菌株的DFU 创面。尽管如此，笔者还是建议使用此类敷料的时间不应超过2 周，如White 等［48］所述。对于特大面积的创面，尤应关注其对局部和全身的不良反应。另外，纳米颗粒比传统配方提供了更高的银含量，因此我们在临床应用时需要进一步研究不同配方的敷料之间的收益/风险比。

作者贡献度说明：

王徐红：文献检索与收集，论文撰写：徐磊：文献检索与收集；柳国斌：论文撰写的指导与修正。

所有作者声明不存在利益冲突关系。