二氧化钛纳米颗粒对小鼠胚胎发育的作用及其机制探讨

罗莺儿 郭义红 梁婷 张静 陈慧*

纳米技术广泛应用于医药，农业等领域，据报道口服暴露于纳米颗粒（NPs）后，NPs 会积聚在心、肝、脾、肺、肾等地方，并扰乱小鼠和大鼠的葡萄糖和脂质稳态［1，2］。TiO2NPs 作为食品添加剂（欧洲为E171）已被广泛应用于脱脂牛奶和糖果等食品的生产过程。在离体胎盘灌注模型中，已发现所有胎盘组织和50%的胎粪样品中都存在Ti，表明TiO2NPs 可能存在母胎转移［1，2］。E171 是由锐钛矿和/或金红石型组成的TiO2NPs 粉末，平均粒径为104.9±44.9 nm［1］。据推测，纳米颗粒的作用取决于它们的大小、形态、迁移速率和消耗量，目前尚无研究充分探索平均粒径100 nm 的TiO2NPs 对母胎健康的风险［2］。

1 材料与方法

1.1 实验动物3 周龄的C57BL/6J 小鼠，雌性32只，雄性16 只，均购自中山大学（实验动物中心东校园）（生产许可证号SCXK（粤）2021-0029），并饲养于中山大学动物中心的SPF 级环境中（使用许可证号SYXK（粤）2020-0107）。所有动物实验都得到了动物保护和使用委员会的批准（2022-015）。

1.2 试剂TiO2NPs（粒径100 nm，锐钛，亲水，上海麦克林生化科技股份有限公司，中国）；兔抗小鼠NF-κB p65 抗体（Abcam，英国）；兔抗小鼠β-Actin 抗体（CellSignaling Technology，美国）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（BS10950，Bioworlde，中国）；RIPA 裂解缓冲液（P0013B，碧云天，中国）；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物（P1045，碧云天，中国），BCA 蛋白测定试剂盒（CW0014S，康为世纪，中国）。

1.3 仪器纯水机（Spring-S40L，中国）；精密移液枪（Eppendorf 公司，德国）；超声波清洗机（SB-5200DT，新芝生物，中国）；冷冻研磨机（JXFSTPRPCL，上海净信）。

1.4 分组及处理将小鼠饲养8 周龄后，随机分为4 组，即正常对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组8 只雌鼠，按照雌鼠：雄鼠=2∶1 的比例合笼。第二天检查雌鼠阴栓存在记为GD0.5，自GD0.5 起至GD17.5 天，分别灌胃给予0 mg/kg/d、10 mg/kg/d、50 mg/kg/d、250 mg/kg/d 的TiO2NPs，剂量设置基于先前研究［3］。为获得均匀的悬浮液，在配制后在超声波清洗机中震荡30 分钟。

1.5 组织收集在GD17.5 时对母鼠实施安乐死，解剖母鼠，取心、肝、脾、肺、肾、脑、子宫，仔细分离胎盘、胎鼠组织，拍照及称重记录后组织标本在-80℃下保存供进一步分析。

1.6 组织匀浆及蛋白定量整块胎鼠组织按1∶9的重量体积比，加入RIPA 裂解缓冲液于冷冻研磨机中充分裂解，4℃条件下12 000 rpm 离心30 min后收集上清。使用BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度后，将蛋白定量至每组总蛋白60 μg。

1.7 蛋白免疫印迹实验进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜后裁剪条带，按照说明书指示将稀释后的兔抗小鼠NF-κB P65 抗体和兔抗小鼠β-Actin 抗体分别作为一抗，在4℃条件下过夜孵育相应条带。按照说明书指示用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 作为二抗与上述一抗结合，室温摇床缓慢摇动孵育1～2小时。以β-Actin 作为内参对照。

1.8 统计学分析蛋白免疫印迹实验采用ImageJ软件进行数据转换，数据采用GraphPad8.0.2 分析处理。各组检测结果以平均值±标准差（x ±SD）表示，采用独立样本t检验比较各处理组与正常对照组均值，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TiO2NPs 对妊娠小鼠体重的影响见图1，随着TiO2NPs 给药剂量增加，GD17.5 时妊娠母鼠体重呈轻微降低趋势，但差异不具有统计学意义。

图1 GD17.5 时TiO2NPs 各剂量组母鼠的体重（n≥7）

2.2 GD17.5 时TiO2NPs 各剂量组母鼠的器官系数见图2，与对照组相比，TiO2NPs 高剂量组肝器官系数显著降低（P＜0.05）（图2 B），而各剂量组心、脾、肺、肾、脑的器官系数，差异均不具有统计学意义（图2 A，C-F）。

图2 GD17.5 时TiO2NPs 各剂量组母鼠的器官系数

2.3 胎鼠大体外观形态见图3，相对于对照组，其他各剂量组随TiO2NPs 给药剂量增加，出现异常胎鼠比例增多，胎鼠发育不良，体型偏小，呈现胎儿生长受限趋势（图3）。

图3 四组胎鼠大体外观形态

2.4 胎鼠中NF-κB 蛋白水平升高见图4，蛋白免疫印迹实验条带图（图4 A）显示，随着TiO2NPs剂量增多，胎鼠中NF-κB 蛋白水平呈现逐渐升高趋势。相比于对照组，高剂量组（P＜0.05）NF-κB蛋白水平相对定量明显升高，差异具有统计学意义（图4B）。

图4 各剂量组胎鼠的NF-κB 蛋白水平

3 讨 论

体重和器官系数是实验中常用的观察终点指标，综合反映动物机体中毒效应［4-6］。器官系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；器官系数减小，则表示脏器萎缩及其他退行性改变等［7］。在本研究中TiO2NPs 各处理组妊娠母鼠的体重呈稍降低趋势，但差异不具有统计学意义。与对照组相比，TiO2NPs 高剂量组肝器官系数显著升高。这与先前研究一致，据报道小鼠经口暴露TiO2NP会引起肝炎细胞浸润和肝纤维化，这可能与NFκB 上调有关，并通过TGF-β/Smads/MAPK/Wnt 信号通路介导［8，9］。相比于对照组，虽然TiO2NPs 各处理组心、脾、肺、肾、脑的器官系数，差异均不具有统计学意义，但心、脾器官系数呈现倒U 形的剂量-反应关系，即低剂量升高，高剂量降低的趋势，这是生物适应环境压力源（例如重金属，有机污染物，有毒代谢物）的一种负反馈非特异性适应。施加任何负荷都会迫使系统更加努力地工作，并增加代谢成本以抵消负荷，从而保持健康，但在矫枉过正期间，这种变化会被观察到性能增强，但这些压力源最终会对稳态过程造成改变或破坏［10］。

Ling Chen 等的研究表明，随着TiO2NPs［粒径（10±25）nm］暴露剂量增加，妊娠期糖尿病（GDM）小鼠血糖水平显著升高，体重进一步下降，可检测到胎盘和胎鼠中Ti 含量的积累，这可能进一步损害GDM 小鼠的胎盘结构，从而加剧胎儿发育异常（如胎儿体长、尾长、体重等数值下降，异常胎儿数量增多）。NF-κB 通路在炎症和免疫，以及胚胎发育过程中至关重要，NF-κB 激活使IL-6、TNF 和CXCL2 等炎症因子表达增加［11］。据报道E171 破坏小鼠血睾屏障，诱导炎症，并引起生精小管中的生殖细胞脱落［12］。在本研究中，随着口服暴露TiO2NPs 剂量增加，胎鼠中NF-κB P65 蛋白表达水平显著升高，且异常胎鼠增多，可能与TiO2NPs 介导胎鼠炎症反应有关。

因此，TiO2NPs 可能透过小鼠母胎屏障，产生一定的炎症效应，但未来仍需更多研究确定TiO2NPs 造成母胎损伤部位及机制。