基于电子鼻技术的黄精霉变快速无损鉴别研究

拱健婷，关佳莉，李 莉*，梁 如，于淑琳，丛 悦，赵艺萌，徐媛媛，邹慧琴*

（1.首都医科大学附属北京中医医院 北京市中医药研究所，北京 100010；2.北京中医药大学 中药学院，北京102488）

黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricumRed.或多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua.的干燥根茎[1]，作为传统中药在我国沿用已久。2002 年黄精被列入《既是食品又是药品的物品名单》，至今也是国家卫生健康委员会公布的药食同源品种[2-3]。因其具有药食同源的特性，黄精具有较高的经济价值，以黄精为原料研发出的中成药或汤药、保健品、食品、化妆品等市场需求量逐步增长。截至2019 年，我国注册黄精保健食品达351 种[4]，黄精的年需求量为3 500 ～ 4 000 t[5]。但是由于黄精富含多糖，因此黄精贮藏过程中极易产生霉变变质现象。黄精每年因霉变造成较大的损失，霉变黄精早期的检测与诊断对保证其质量具有重要的作用。此外，霉变会导致中药有效成分大量流失，影响临床疗效；霉变中药真菌产生的多种真菌毒素会对患者的肝脏、肾脏、神经和造血系统等造成严重损害，甚至可能诱发癌症，威胁健康，故有“霉药不治病，甚至害人命”的说法[6-7]。因此，对黄精霉变进行检测与诊断对于减少黄精经济损失和临床用药安全也具有重要意义。

目前评价中药霉变的主要方法为性状鉴定法和理化测定法，性状鉴别存在主观性、经验性，常规的真菌鉴定方法耗时费力且昂贵，无法满足自动化、现场快速的检测需求[8]。在中药霉变过程中会有霉味、腐臭味、酸味或甜味等，这些气味的主要成分是微生物产生的羟、醛、硫化物等，可以通过气味变化了解中药霉变情况。电子鼻是模拟人类嗅觉的智能感官仪器，其灵敏度很高，气味的检测限可达ppb 级甚至ppt级水平。关于电子鼻技术在霉变检测中的应用和研究主要集中于谷物大米[9]、玉米[10]、小麦[11]、燕麦[12]等，近年来电子鼻在草莓[13]、苹果[14]和家电“霉味”[15]的检测，及中药肉豆蔻[16]、川芎[17]的霉变预警上的探索应用也有报道，可见电子鼻在霉变检测方面具有巨大潜力。为此，本研究采用电子鼻技术对黄精气味信息进行检测，获取样品的气味指纹图谱，再联合模式识别算法分析，从而实现快速识别黄精是否发霉。

1 材料与方法

1.1 药材

6 批黄精样品均于2019 年7 月采集于辽宁省瓦房店市，经北京市中医药研究所李莉研究员鉴定为百合科植物黄精Polygonatum sibiricumRed.的干燥根茎。3 批未霉变黄精（HJ5、HJ6、HJ7）；3 批霉变黄精样品为2019 年7 月至2021 年7 月储藏过程中霉变所取样品（MHJ5、MHJ6、MHJ7），霉变黄精药材表观颜色加深，可闻到异味，明显观测到生长的菌丝体。样品储存于北京市中医药研究所。

1.2 仪器

α-FOX3000 型电子鼻（法国Alpha M.O.S.公司），包括HS-100 型自动顶空取样器、空气发生器和12 根金属氧化物传感阵列（LY 型传感器LY2 /LG、LY2 /G、LY2 /AA、LY2 /GH、LY2 /gCTL、LY2 /gCT 构成Sensorchamber1，TP 型传感器T30 /1、P10 /1、P10 /2、P40 /1、T70 /2、PA/2 构成Sensorchamber 2），每根传感器对挥发性成分的响应性能不同，见表1[18]；FW-135 型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；BS-124S 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

表1 α-FOX3000 型电子鼻传感器及其检测范围Tab.1 α-FOX3000 electronic nose sensors and its detection range

1.3 黄精气味检测方法

1.3.1 检测参数 参照于淑琳[19]方法进行黄精气味检测，检测参数如下：载气流速为150 mL/min；搅动速度为250 r/min；进样体积为2 500 μL；注射速度为2 500μL/s；注射针温度为60℃；数据采集时间为120 s；采集周期为1 s；延迟时间为600 s。

1.3.2 样品制备 分别精密称取0.3 g 黄精/霉变黄精样品粉末（65 目标准筛），装入10 mL 顶空进样瓶，加盖密封，放入电子鼻自动进样器样品盘中进行检测，获取气味指纹图谱见图1。每份样品平行检测6次。

图1 样品的气味指纹图谱Fig.1 Odor fingerprint of sample

1.4 数据处理方法

黄精的气指纹图谱由12 根传感器的120 s 数据组成，通常选取峰值或波谷作为特征点，通常同一样品此处的相对标准偏差较低，不同样品之间的差异通常最大[20]，因此，在数据分析中，选择12 根传感器响应绝对值的最大点响应值为分析指标。利用SPSS 19.0 对数据进行t检验、主成分分析、聚类分析、逐步判别分析，simca-p 13.0 进行偏最小二乘判别和VIP 分析，Origin7.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 黄精与霉变黄精电子鼻响应值分析

黄精与霉变黄精在电子鼻12 根传感器上的响应值见图2，可以看出霉变黄精在12 根传感器上的响应绝对值均高于黄精。对所采集的样品响应值进行分析，通过四分位距法剔除异常数据（HJ7-1）后进行t检验，结果显示黄精与霉变黄精在电子鼻12 根传感器上的响应值均存在极显著差异（P＜0.001），见表2，黄精与霉变黄精气味差异具有统计学意义。以黄精响应值为参照，计算二者的差异率，结果显示黄精与霉变黄精的气味在传感器差异率在6.839 5% ～122.873 9%，在传感器S1 上差异率最小，在传感器S2 上差异率最大，且在S2、S3、S6、S11 的响应值差异率均超过 80% ，是黄精霉变气味特征的重要区别点，其中，S6 响应值差异率较大（110.751 3%）也与电子鼻传感器 S6 对黄精及霉变黄精响应值较低存在一定的关系。说明挥发性气味特征差异为电子鼻的分析检测提供了可能，基于气味进行黄精霉变与否的鉴别是可行的。

图2 黄精与霉变黄精电子鼻响应值散点图Fig.2 Scatter Chart of Rhizoma Polygonatum and moldy Rhizoma Polygonatum

表2 黄精及霉变黄精的电子鼻传感器响应值Tab.2 Response value of Rhizoma Polygonatum and moldy Rhizoma Polygonatum

2.2 黄精与霉变黄精判别模型的建立

2.2.1 主成分分析 主成分分析（PCA）是电子鼻构建判别模型时常用的统计方法，其可以消除数据中相互重叠的信息，将电子鼻12 根传感器的特征降维，实现用少数原始变量线性组合的关键变量表征原变量的数据特征[21-23]。对黄精与霉变黄精样品电子鼻检测数据进行PCA 分析，结果见图3，第一主成分方差贡献率为99.03%，第二主成分方差贡献率为0.78%，二者累积方差贡献率为99.81%，说明保留的两个主成分包含了样品原始特征中的大部分特征信息。

图3 黄精与霉变黄精主成分分析得分图Fig.3 Scatter chart of principal component analysis

黄精与霉变黄精在PCA 散点图上明显分为 2 个区域，PCA 分析能够实现黄精霉变与否的正确判别。黄精样本主要分布在第二、三象限，除MJH5-5 外，霉变黄精样品均分布在第一、四象限，两类样品间的差异明显，且差别主要体现在信息权重较大的第一主成分上。进一步对12 根传感器进行Loadings 分析，发现传感器S7、S8、S11、S12 对第一主成分的贡献度最大。此外，黄精样品电子鼻数据在主成分分析图上相对集中，霉变黄精电子鼻数据在主成分分析图上较为分散，可能与霉变黄精样品霉变的程度存在一定的关系。

2.2.2 聚类分析 聚类分析是电子鼻数据处理中常用的模式识别算法之一。分层聚类分析是应用最广的聚类分析方法，是一种将研究对象分为相对同质的群组的统计分析技术，分层聚类分析是依据个体或变量的数量关系来分类，客观性较强[24]。将黄精与霉变黄精样品电子鼻检测数据进行聚类分析，根据欧式距离进行样本的聚类，最终样本聚为两大类，黄精及霉变黄精样品的分层聚类分析图，见图4，正判率为97.14%，其中仅一份霉变黄精样本（MHJ5-5）被聚类到黄精样品中，与主成分分析结果一致，其余聚类全部正确。在霉变黄精样品中，MHJ5 样本整体的电子鼻响应值较MHJ6、MHJ7 样本低，MHJ5-5 电子鼻响应值较低，故错判为未霉变黄精。

图4 聚类分析结果Fig.4 Cluster analysis results

2.2.3 逐步判别分析 具有筛选能力的判别分析法统称为逐步判别分析。在判别分析的过程中，往往有很多变量对判别结果有影响，但影响大小不一。当判别变量较多时，适当的变量筛选有利于建立的判别函数的稳定性。逐步判别分析的基本思想是采用“有进有出”的算法，即根据变量的重要性逐步引入变量，而最初引入的变量也可能因为后引入的新变量而失去其重要性被删除。引入或删除变量的每个步骤都需要进行统计检验，确保最终的判别函数只保留重要变量[25-26]。

71.43%的样本（霉变黄精13 份，黄精12 份）被随机抽取以形成训练集，剩余28.57%的样本（霉变黄精、黄精各5 份）构成测试集以评估所建逐步判别模型的性能。模型的F临界值为2.09，两类样本间马氏距离200.53。通过逐步判别分析，依次选入5 个变量S12、S1、S2、S5 和S4 作为判别分析的指标。根据逐步判别函数系数，霉变黄精的判别函数为YMHJ= -1 837.41 + 28 310.58S1+ 7 047.37S2+ 6 737.68S4-13 593.4S5+ 106.96S12，黄精的判别函数为YHJ=-2 276.54 + 34 299.97S1+ 10 155.68S2+ 15 703.75S4-28 543.5S5- 368.39S12，基于上述函数训练集结果显示两类样本的正判率均为100%，说明判别模型识别能力强。使用获得的判别函数去判别测试集样本，均判别正确，正判率为100%，见表3。通过判别分析，电子鼻可以区分黄精和霉变黄精，效果理想。

表3 黄精样品逐步判别模型的建立与验证结果Tab.3 Multivariate stepwise analysis model

2.2.4 偏最小二乘判别分析 PLS-DA 是一种集主成分分析、典型相关分析、多元线性回归分析于一体的常用多变量分析方法。它具有清晰直观的分析结果、较高的预测精度和广泛的实用性，在中药质量评价和控制的过程中具有广泛的应用[27]。采用SIMCA-P13.0 软件对黄精与霉变黄精样品进行PLSDA 分析，表示模型拟合程度参数R2Y值为0.973，表示该模型预测能力参数Q2值为0.952，表明该模型具有良好的拟合度、较高的稳定性和预测率。PLSDA 分析结果见图5，两种类型的样品集中在两个不同的区域，这表明黄精在霉变后气味信息发生了显著变化，PLS-DA可以实现黄精霉菌的快速准确识别。

图5 黄精与霉变黄精PLS-DA 分析（A）及VIP 分析(B)Fig.5 Score scatter plot of by PLS-DA（A）and VIP analysis（B）

变量重要性分析值（Variable Importance for the Projection，VIP）可以量化每个变量对分类模型的贡献，便于筛选重要的分类变量。VIP 值越大，该变量在两种样本之间的差异就越显著。对12 根传感器的VIP 值进行排序，S7 ～ S12 VIP 值大于1，这表明以上指标是判别模型中体现黄精与霉变黄精差异性的主要变量，对黄精霉变的分类鉴别具有显著影响，而其余6 根传感器的影响较小。此外，S7 ～ S12 为TP型传感器，根据传感器的性能，可能是黄精霉变后芳香族化合物、氨气、胺类、甲烷、烷烃类成分种类及含量发生了显著变化。

3 讨论

霉变是常见中药变质现象之一，直接影响中药的质量与安全。准确评价中药霉变与否是药品安全生产和使用的重要保障。目前，评价中药霉变的主要方法是性状鉴定法和理化测定法，前者最为常用。文献报道，现存在霉变的中药通过撞刷、抢水洗、沸水喷淋、酒洗、醋洗、油擦、热炒、热蒸等方法除去表面霉菌后干燥重新流入市场的现象，并且刷去霉菌的药材和正常中药很难区分，对鉴别者的经验要求很高，且某些药物还存在假性霉变现象的干扰。随着技术的发展，中药微性状鉴定法应用到中药霉变鉴别中，通过观察药材组织及表面的菌丝体和芽孢能鉴别出“水洗货”霉变木瓜、霉变辛夷[28]；刘吉爽等[29]采用柱色谱、薄层色谱等技术分离制备了葵花盘霉变标志物，对多糖、皂苷及蛋白质含量较高的植物药材的霉变评价具有一定的适用性；另外，酶联免疫测定法[30]、胶体金免疫层析法[31]、高效液相色谱法[32]和液相色谱-质谱联用法[9]等应用于霉变中药多种真菌毒素的检测。相较于依赖鉴别经验的传统性状鉴定法和复杂的常规真菌鉴定方法，电子鼻技术更为客观便捷。电子鼻可以将传统鉴定经验转化为客观数据，量化不同样品之间的气味差异，样品预处理过程相对简单，数据分析速度快。

本研究以黄精为研究载体，采用电子鼻技术提取黄精和霉变黄精气味特征指纹，联合无监督的主成分分析、聚类分析及有监督的逐步判别判别分析、偏最小二乘判别分析建立了黄精霉变与否定性鉴别模型。对比不同的判别模型结果，主成分分析中S7、S8、S11、S12 对第一主成分的贡献度最大，逐步判别分析依次选入S12、S1、S2、S5、S4 共计5 个变量作为判别分析的指标，偏最小二乘判别分析中贡献度较大的传感器为S7 ～ S12，不同判别模性中传感器S12 对判别结果均有较大贡献，另外主成分分析、偏最小二乘判别分析结果较为一致，TP 型传感器对黄精霉变与否的气味影响更为显著。综合来看，LY 型传感器S1、S2、S4、S5 和TP 型传感器S7 ～ S12 对黄精霉变判别模型贡献较大，提示黄精霉变后氧化气体、有机胺类、硫化物、短链烷烃、芳香族化合物等成分发生了变化。可以电子鼻分析结果作为一个方向性的指导，采用气相色谱-质谱联用、气相色谱离子迁移谱等手段针对以上成分进行分析，进一步研究黄精霉变前后挥发性成分的构成差异，为黄精霉变的有效鉴别提供科学的参考依据。研究结果表明，电子鼻技术结合化学计量学能有效地检测到黄精与霉变黄精的气味差异，无监督和有监督判别模型均可以准确实现黄精霉变与否的定性鉴别，为黄精霉变评价提供了一种快速而有效的方法，在中药霉变鉴别上有较好的应用前景和推广价值。

本研究依托黄精储藏过程中自然霉变以获取霉变样品，故而收集到的样品量少，导致样品的代表性存在一定的局限性。基于此，在今后的研究中应收集更多、更具代表性的样品，一方面进行模型验证；另一方面，在本实验判别模型的基础上，可利用判别应用中不断累积的新资料进行完善，增加其可靠性，建立更完善的判别模型。此外，本研究只是对黄精霉变的初步探索，还有许多问题值得进一步研究，例如黄精与霉变黄精具体有哪些气味成分的区别，它们是否与药效成分有关，如何跟踪黄精霉变过程中的气味变化，找到即将发生霉变的最佳处理时刻来控制贮藏条件，从而减少黄精霉变的发生，课题组将继续对黄精霉变气味的物质基础进行进一步的探索。

4 结论

电子鼻技术可以实现黄精及霉变黄精气味信息客观化，霉变黄精电子鼻响应绝对值显著高于黄精。电子鼻结合化学计量学方法建立了黄精霉变与否的主成分、聚类、逐步判别、偏最小二乘判别模型，可以从整体气味的角度实现对黄精霉变与否的快速无损鉴定，为黄精霉变快速检测提供了方法参考，保障临床用药安全。