酸枣仁皂苷A 和B 对小鼠睡眠情况干预的机制研究

姜 海 ，陈 健，王 祎，王 葳，续洁琨

［1.北京中医药大学 生命科学学院，北京 100029；2.北京中医药大学 中药学院，北京 100029；3.吉林农业大学 食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；4.长春维石检测技术服务有限公司，吉林 长春130102；5.吉林省农产品加工业促进中心，吉林 长春 130022; 6.中泰宜佳健康科技（北京）有限责任公司，北京101300］

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubeMill 的干燥成熟种子，自古被用作为安神养心类药物[1]，现代医学则证明了其具有显著的催眠镇定作用[2]。酸枣仁皂苷属于四环三萜和五环三萜类皂苷化合物，目前已从酸枣仁中分离出超过50 种，其中以酸枣仁皂苷A 和B 为代表，具有显著的药理学功效，包括神经保护、血管再生和催眠镇静作用等[4-5]。

相关研究表明，酸枣仁皂苷A 的功效要略高于酸枣仁皂苷B[6]，且对于酸枣仁皂苷A 辅助睡眠的研究也稍多[7]。酸枣仁皂苷A 和酸枣仁皂苷B 的摄入主要是改变脑中神经递质GABA、5-HT 等的含量从而最终提高睡眠质量，且两者在肠道中依靠相关微生物代谢存在相互转化机制[8]。但也有研究表明，皂苷类物质除对机体中神经递质类物质代谢存在干预作用外，某些成分或次生代谢产物可能会影响血脑屏障甚至直接对脑组织产生一定的影响[9]。而酸枣仁皂苷对脑组织的影响尚未见研究。本研究旨在借助蛋白组学和生物信息学等方法，通过对受试动物下丘脑组织在蛋白水平的变化情况及两者的差异研究，为酸枣仁皂苷A 和酸枣仁皂苷B 对机体睡眠情况干预的潜在机制解析提供理论基础。

1 材料

1.1 受试动物及场地

SPF 级雄性昆明小鼠，8 ～ 12 周龄，体质量为22 ～28 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SPF 洁净级、实验动物行为观测旷场、动物行为监测录制设备由长春维石检测技术服务有限公司提供。

1.2 药物与试剂

酸枣仁皂苷A（CAS：55466-04-1）、酸枣仁皂苷B（CAS：55466-05-2）购自成都格利普生物科技有限公司；地西泮（国药准字H21022887，东北制药集团沈阳第一制药有限公司）。TMT® Mass Tagging Kits and Reagents 购自美国Thermo Fisher Scientific；Bradford 蛋白定量试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；二硫苏糖醇（DTT，D9163-25G）、三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB，T7408-500ML）、氨水（221228-500ML-A）、三氟乙酸（TFA，T6508-100ML）及碘代乙酰胺（IAM，I6125-25G）购自美国Sigma-Aldrich；LC-MS 级超纯水、乙腈（A955-4）和 甲 酸（A117-50）购 自 美 国Thermo Fisher Chemical；丙酮（11241203810051）购自北京化工厂；ProteoMiner 低丰度蛋白富集试剂盒（1633007）购自美国Bio-Rad；十二烷基硫酸钠（SDS）和尿素购自国药集团。

1.3 仪器与设备

EASY-nLCTM 1200 纳升级UHPLC（LC140）、Q ExactiveTM HF-X 型质谱仪、Multiskan FC 型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific）；D3024R 型低温离心机（美国Scilogex）；Scan Speed 40 型冷冻干燥机（丹麦Labogene）。

2 方法

2.1 动物实验设计

受试动物分为A 组（酸枣仁皂苷A）、B 组（酸枣仁皂苷B）、阳性对照组（地西泮干预）、空白对照组（生理盐水）；设置给药量低剂量组：10 mg/（kg·d），中剂量组：20 mg/（kg·d），高剂量组：30 mg/（kg·d）；地西泮摄入量：6 mg/（kg·d）；受试动物均按照给药体积200 μL/d 给药；给药时间为下午4 时。所有动物在适应环境5 d 后进行连续21 d 给药，随后脱颈处死，在无菌环境下进行开颅，取下丘脑组织液氮速冻后于-80℃冻存备用。

2.2 睡眠稳定性判定

单只受试动物若连续10 min 未出现行动迹象视为入睡；每组受试动物睡眠稳定性按照1 h 内进入睡眠状态的数量进行判定，即1 h 内睡眠多并且在一段时间内没有出现苏醒即睡眠稳定，反之则不稳定。

2.3 TMT 定量蛋白组学

选取空白对照组、A 组和B 组的高剂量组下丘脑组织进行TMT 定量蛋白组学试验。

2.3.1 总蛋白提取 在严格低温条件下使用PASP蛋白裂解液对下丘脑蛋白进行提取，保存备用[10]。

2.3.2 SDS-PAGE 凝胶电泳 使用考马斯亮蓝法对“2.3.1”中提取液进行蛋白浓度测定，使用上样量20 μg 进行12% SDS-PAGE 凝胶电泳，浓缩胶电泳条件为80 V、20 min，分离胶电泳条件为120 V、90 min。电泳完成后使用R-250 染色后进行洗脱。

2.3.3 TMT 标记 根据ZHANG H 等[11]方法对蛋白进行TMT 标记，除盐后冻干备用。

2.3.4 馏分分离 按照GAO J 等[12]的条件使用液相色谱法进行馏分分离。过程中每分钟收集1 管，合并10 个馏分，冻干后各加入0.1%甲酸溶解，保存备用。

2.3.5 液质检测 将“2.3.4”中各馏分上清液取1 μg 上机按GAO J 等[12]的条件进行液质分析，生成质谱原始数据（.raw）用于后续生物信息学分析。

2.4 数据分析

2.4.1 蛋白质的鉴定和定量 根据Mus_musculus_uniprot_2021_7_15.fasta.fasta (86544 sequences) 蛋 白数据库使用Proteome Discoverer 2.4 软件搜索结果谱图。所得结果进行t检验，将定量差异显著的蛋白质（P＜ 0.05, |log2FC|＞0.25（FC＞1.2 orFC＜0.83[fold change,FC]）定义为差异表达蛋白（DE 蛋白）。

2.4.2 DE 蛋白功能分析 使用KEGG 数据库进行功能蛋白家族及通路分析[13]；针对DE 蛋白进行聚类热图分析和KEGG 的通路富集分析[14]，并使用STRING DB 数据库（http://STRING.embl.de/）预测可能的蛋白质间相互作用[15]。

3 结果

3.1 受试动物睡眠情况

受试动物的睡眠情况见图1。相较于对照组，各给药组的睡眠情况均随给药时间的延长而稳定。其中，阳性对照组从第11 天开始全部在1 h 之内入睡；A 组睡眠效果弱于阳性对照组，但是高剂量组效果显著优于中、低剂量组，在第5 天时基本可以达到1 h之内入睡；酸枣仁皂苷B 的效果略优于酸枣仁皂苷A，低、中、高剂量组分别在第13、7、5 天达到1 h之内入睡。过程中某一只受试动物未入睡可能归因于外界干扰。故酸枣仁皂苷A 和B 均产生了辅助睡眠作用，且存在一定的剂量依赖性。

图1 受试动物1 h 未入睡数量Fig.1 The number of test animals not falling asleep in 1 h

3.2 受试动物下丘脑蛋白表达差异

3.2.1 蛋白差异分析 蛋白组学分析中共鉴定到6 740 个符合质控要求的蛋白用于差异分析。各组中DE 蛋白的聚类热图分析结果如图2 所示。与对照组相比，A 组（图2A）下丘脑蛋白显著上调39 种，显著下调54 种；B 组（图2B）显著上调20 种，显著下调131 种。所有DE 蛋白名称及描述见热图右侧图注。

图2 给药组和对照组间差异蛋白聚类热图Fig.2 DE proteins heat map between test groups and control group

3.2.2 KEGG富集分析 DE蛋白的KEGG富集分析结果见图3，将各组之间存在显著性差异 （P＜0.05）的通路总结见表1。与空白对照组相比，除与脑组织蛋白表达不存在必然联系的通路外，摄入酸枣仁皂苷A 还是酸枣仁皂苷B 引起了细胞紧密连接（Tight junction，ID：04530）中DE 蛋白的显著差异，包括肿瘤抑制蛋白DLG1（ID：Q3UP61）、丝状肌动蛋 白AFADIN（ID：E9PYX7）、Rab8A 蛋 白（ID：Q0PD50）、多重PDZ 结构域蛋白（ID：Q8VBX6）、非经典蛋白激酶C iota（ID：Q62074）、微管链样蛋 白TUBAL3（ID：Q3UX10）、Claudin-11（ID：Q60771）、丝氨酸/ 苏氨酸蛋白磷酸酶2A（ID：Q8BG02）、类InaD 蛋白（ID：A0A571BEG7）。同时，上述DE 蛋白的差异化表达，可能是造成酸枣仁皂苷A 和B 药效差异的原因之一。

图3 给药组和对照组间KEGG 富集气泡图Fig.3 KEGG enrich results between test groups and control group

表1 KEGG 通路富集结果（P ＜ 0.05）Tab.1 KEGG pathways enrich results（P ＜ 0.05）

3.2.3 细胞紧密连接DE 蛋白互作分析 细胞紧密连接过程见图4，其中标注了已发现的DE 蛋白，较对照组均表达下调。酸枣仁皂苷A 的摄入引起了aPKC（ID：Q62074）、MUPP1（ID：Q8VBX6）、DLG1（ID：Q3UP61）、Rab8（ID：Q0PD50）及Afadin（ID：E9PYX7）的下调，这些蛋白和细胞极性与增殖、粘附连接的建立及细胞迁移等过程有关。酸枣仁皂苷B 的摄入引起了Claudin（ID：Q60771）、PP2A（ID：Q8BG02）、aPKC（ID：Q62074）、PATJ（ID：A0A571BEG7）、MUPP1（ID：Q8VBX6）、DLG1（ID：Q3UP61）、Claudin2（ID：Q60771）及Tuba（ID：Q3U-X10）的下调，这些蛋白同样影响着细胞极性与增殖、紧密连接的建立等过程。

图4 细胞紧密连接中的差异蛋白Fig.4 The DE proteins in tight junction process

4 讨论

研究表明部分DE 蛋白与机体的睡眠或脑健康存在密切关系。杨芙蓉[16]发现，神经元细胞中的Rab8蛋白差异表达可以干预GLUT4 蛋白的表达，进而影响神经细胞对葡萄糖的代谢，从而影响睡眠。刘胜杰[17]发现，脑组织中Afadin 的敲减将阻断Rap1 活化，起到对血脑屏障的保护作用并升高血脑屏障通透性，而Claudin 紧密连接蛋白家族在组成紧密连接的血脑物理屏障和维持细胞环境稳定性方面具有重要作用[18]，PP2A 差异化表达可以抑制Tau 蛋白过磷酸化从而改善机体学习记忆能力[19]。其他DE 蛋白虽未见报道与机体睡眠存在直接关系，但大多与神经调节存在密切关系，如DLG1 和Tuba 等[20-21]，所以推测酸枣仁皂苷A 和B 的摄入，一方面可以直接对下丘脑中紧密连接过程进行调控，从而干预血脑屏障；另一方面，其摄入也对神经细胞起到调节作用。

很多中药成分被报道可以起到调节机体血脑屏障通透性的作用，如：益母草碱、冰片、丹参多酚酸等[22-24]，且冰片、川芎中活性成分可透过血脑屏障[25]。睡眠情况与血脑屏障通透性和紧密连接蛋白的表达也存在着密切关系[26]，很多药物也被证明通过干预机体血脑屏障产生辅助睡眠作用，包括与本研究中类似的酸枣仁汤以及冰片等[27-28]。其中，王育虎[28]发现，酸枣仁汤的摄入增加了血液及脑组织一氧化氮合酶含量，推测其可能通过舒张毛细血管、增大血脑屏障通透性从而产生药效。此外，郭艳丽等[29]的研究推测酸枣仁可能通过影响体内天门冬氨酸氨基转移酶的活性而发挥抗焦虑作用。

中药成分影响血脑屏障的途径有很多，如：脂溶性小分子穿透血脑屏障、抑制P-糖蛋白对血脑屏障的限制、5-羟色胺对血脑屏障通透性的增强、一氧化氮对胞饮作用的增加等[30]。酸枣仁皂苷具有一定脂溶性，有可能透过血脑屏障进入脑组织。但是本研究结果表明，酸枣仁皂苷A 和B 的摄入既引起细胞紧密连接相关蛋白的差异化表达，也对神经细胞活性产生了干预作用，其他研究表明其摄入对某些神经递质表达产生影响[31]，推测其也可能通过改变血脑屏障通透性从而使其他物质进入脑组织这一间接方式产生药效。

5 结论

本研究证明了酸枣仁皂苷A 和B 的摄入均会对下丘脑中蛋白的表达产生影响，相关DE 蛋白集中于细胞紧密连接过程中，反映出药物摄入后可能对血脑屏障及其通透性产生影响，从而产生辅助睡眠的作用，两者摄入后DE 蛋白的差异可能是药效差异的原因。此外，本研究还为酸枣仁皂苷的现代药理学评价体系建立提供了基础数据，为该药物后续药效评价及机理探究提供了一定的理论基础。两种皂苷同时摄入是否会产生协同增效有待进一步研究。