基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR对九香虫及其混伪品进行鉴定

王孟虎　孙一帆　左亚锋　孟祥松　栗进才　俞浩　许亮　康廷国

摘 要：目的：基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR对市售九香虫、小皱蝽及其掺杂样品进行鉴定。方法：利用通用引物COI进行扩增并测序，构建NJ系统发育树、二级结构并计算种内种间遗传距离；基于COI序列设计九香虫、小皱蝽特异性引物并进行电泳，比较电泳条带；基于COI引物进行SBYR荧光定量PCR，观察单一样品及不同比例混合样品的熔解曲线及其Tm值。结果：利用MEGA 11.0软件分析显示九香虫、小皱蝽分别单独聚为一支，其种间遗传距离均大于0.22，种内遗传距离均小于0.02；两者的二级结构在整体框架具有明显不同。基于特异性引物扩增的九香虫、小皱蝽均出现单一条带，不同比例的混合样品与混合引物进行扩增均出现2条条带。基于COI引物扩增的九香虫、小皱蝽熔解曲线Tm值分别为75℃、89℃，不同比例混合样品的熔解曲线Tm值分别在75.00℃、89.00℃出现两个峰值。结论：DNA条形码能够及二级结构准确鉴定九香虫、小皱蝽；多重PCR及基于SBYR荧光定量PCR不仅能够准确对单一九香虫、小皱蝽进行鉴定，也能够对不同比例的混合样品进行准确鉴定。

关键词：DNA条形码；多重PCR；荧光定量PCR；二级结构；九香虫

中图分类号：R932  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2023）02-0060-06

九香虫为蝽科昆虫九香虫Aspongopus chinensis Dallas的干燥体[1]，其药用历史悠久，是一种药用价值较高、营养价值较高的昆虫类中草药和保健食品[2]，具有抗菌[3]、抗癌[4]、镇痛[5]、抗氧化[6]及改善生殖器官[7]的作用。已报道的九香虫化合物包括脂肪酸、蛋白质、氨基酸、臭气类、核苷类、多巴胺类化合物及其他营养成分。九香虫体内脂肪酸类化合物最多，包括油酸、亚油酸、软酸、软亚油酸、硬亚油酸等[8]。由此可见，九香虫脂肪油主要是不饱和脂肪酸，占70%以上。另外九香虫还富含维生素、微量元素、磷脂、蛋白质及氨基酸，维生素中含有的维生素A及维生素C的含量较高。

市售九香虫常见的混伪品是小皱蝽，小皱蝽除略小于九香虫外，其他形态特征与其相似，小皱蝽常冒充小的九香虫进行销售，若两者进行掺杂，极难鉴别。黄秋强等[9]人借助生物显微镜及扫描电镜对九香虫、小皱蝽进行鉴别，发现两者的区别主要在腹背板。鞠康等[10]人对九香虫及其混淆品微性状鉴别研究，发现在头部、前胸背板、小盾片、腹侧缘、前翅、生殖节等方面均有较明显的区别。李莎等人[11，12]发现九香虫及其混伪品药材性状和显微鉴别可以通过腹背板进行鉴别；通过DNA条形码技术和九香虫的线粒体基因测序技术能够准确鉴定九香虫及其混伪品。

传统鉴定方法可以通过性状、显微进行鉴定，但其无法对掺杂一定比例的九香虫药材准确鉴定掺杂基原。多重PCR技术是基于每个物种基因设计特异性引物，基于特异性引物扩增的产物碱基长度不同，进行电泳后其条带位置不同，进而对物种进行准确鉴定。利用SBYR荧光定量PCR进行扩增，其熔解曲线与碱基长度及碱基组成比例有关，设计的特异性引物扩增的产物碱基组成及长度不同，其熔解曲线亦不相同，根据熔解曲线Tm值不同进行对物种进行鉴定[13]。

1 材料与试剂

1.1 材料

从康美市场购买九香虫正品5批次、小皱蝽5批次，九香虫标记分别为JXC-01？JXC-05，小皱蝽标记分别为XZC-01？XZC-05。所有样品均经孟祥松主任中药师鉴定，所有样品储存均存放在亳州学院冷库内。

1.2 仪器与试剂

实时荧光定量PCR（伯乐，CFX Connect），PCR仪（伯乐，T100）、低温冷冻研磨仪（上海净信，JX-CL）、全自动数码凝胶成像分析仪（上海培清，JS-2000）、JOANLAB多功能混匀仪（群安实验仪器、VN-500Pro）、IKA漩涡混合器（艾卡，Vortex-1）、移液枪（赛默飞世尔）（ThermoFisherF3）、电泳仪（北京六一，EPS300）、粉碎机（美的，MJ-FP12X2-100）、Ezup柱式动物基因组DNA提取试剂盒（生工，FC09KA4055）、DNA分子量标准Marker（2000bp）（生工、B500350-0500）、SYBRGreen染料Mix（生工，I308KA3871）、4SGelRed（BBI，A616697-0500）、2×TaqMasterMix（诺唯赞，7E341F9）、TAE（50×）（biosharp，691176248）、琼脂糖（恒奥生物，EZ6688C178）。

2 方法

2.1 DNA提取

取九香虫、小皱蝽适量，用粉碎机粉碎，称量粉末约30mg加入1.5mL离心管中，并向其中加入180uL的Buffer ACL及研磨珠，在低温冷冻研磨仪研磨1min（60次/秒），低速离心去除泡沫，剩余操作均与Ezup柱式动物基因组DNA提取试剂盒说明书相同，提取的DNA放置在-20℃冰箱内储存备用。

2.2 PCR扩增体系及反应条件

COI序列扩增正反引物详见表1。PCR扩增体系为50μL，含有正反向引物各2.0μL（2.5μmol/L），稳定剂和溴酚蓝燃料（TaqMasterMix）25μL，总DNA4.0μL（约40ng），加去RNA酶水17μL。扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min（35个循环）；72℃延伸5min。

2.3 电泳检测DNA质量

使用2.0%的琼脂糖凝胶液倒入电泳槽中，静置30min，用移液枪吸取PCR扩增产物5.0μL、Marker 2.0μL，在120V電压下电泳25min，取出放置凝胶成像系统中分析，与Marker比较后无杂带并且清晰时拍照保存图像。

2.4 测序

扩增成功的PCR产物委托上海生工进行测序，测序产物为PCR反应物，测序前PCR扩增产物经纯化再进行双向测序，获得双向测序原始序列碱基及峰图。

2.5 数据处理

测序所得的原始序列利用CodonCode Aligner 17.0软件进行查看、拼接校对，去除低质量的序列及引物区，以碱基质量不低于20为标准。将测得的COI序列用软件MEGA11.0比对分析，去除多余的碱基。基于K2P模型进行种间变异位点和遗传距离分析，基于COI序列构建二级结构及系统聚类树，利用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。

2.6 特异性引物设计

根据所测的COI基因序列，利用软件MEGA 11.0比对找到变异位点，利用Oligo 7.0软件手动设计特异性引物并在NCBI上进行引物Blast分析，确保设计的引物对九香虫、小皱蝽均具有特异性，且其PCR扩增长度不同，设计的引物详见表1。

2.7 多重PCR扩增

将特异性引物分别与对应的模板进行扩增，扩增成功后进行电泳，观察扩增产物电泳条带位置。将九香虫、小皱蝽DNA按1：1、3：1、6：1、9：1混合，加入混合引物和单一引物进行扩增，将扩增产物电泳，观察电泳条带位置。

2.8 多重荧光定量PCR[15]

多重荧光定量PCR扩增程序为：95℃ 3min；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 15s，45cycles；熔解曲线程序为：95℃ 1min；58℃ 30s，0.5℃/min，升温至95℃。PCR反应体系为SYBR Green Mix 12.5μL，正反引物各1μL，模板2μL，加双蒸水至25μL。将特异性引物、模板、SBYR染料等混合后分别进行扩增，记录其扩增产物的熔解曲线Tm值。将九香虫、小皱蝽DNA按1：1、3：1、6：1、9：1混合，分别加入混合引物进行扩增，记录其熔解曲线Tm值。

3 结果

3.1 DNA扩增检测

基于COI引物进行普通PCR扩增，产物并分别进行电泳，电泳条带清晰，表明DNA提取及扩增成功。基于COI引物进行荧光定量PCR扩增，扩增产物进行熔解曲线分析，其熔解曲线峰为单峰，说明PCR扩增成功，详见图1。

3.2 种内、种间遗传距离分析

将拼接、去引物的COI碱基序列利用MEGA 11.0软件进行比对，长度为555bp。九香虫种内遗传距离为0.00～0.004，小皱蝽种内遗传距离为0.00～0.009，种间遗传距离为0.225～0.233，具体详见表2。九香虫与小皱蝽种间碱基不同位点有106个，九香虫种内碱基变异位点有2个，小皱蝽种内碱基变异位点有6个。由表可知，九香虫、小皱蝽种内遗传距离均小于0.020，种间遗传距离远大于0.020，说明利用遗传距离能够准确鉴别九香虫、小皱蝽。

3.3 二级结构

利用载体家（https：//www.vectorbuilder.cn/tool/dna-secondary-structure.html）在线网页对所有样品的碱基序列进行二级结构构建，详见图2。由图可知，JXC-01～JXC-03二级结构基本相同，JXC-04、JXC-05二级结构基本一致，JXC-01与JXC-04相比，种内二级结构主要有3处不同。XZC-01、XZC-02种内二级结构基本相同，XZC-03、XZC-04、XZC-05与XZC-01相比分别有2、1、2处主要结构不同。从构建二级结构中可以看出，九香虫种内二级结构大致相同，小皱蝽種内二级结构虽有1～2处不同，但整体框架是相同的。而九香虫与小皱蝽在种间的二级结构整体框架是不同的，具有明显的不同。说明利用二级结构不仅可以对种间进行鉴别，对种内有少量碱基变异的序列也能够显示出来。对于种内变异较少或遗传距离较近的碱基序列，可以通过构建二级结构来更直观地看到发生的碱基变异。

3.4 NJ系统发育树

从GenBank上下载九香虫同属物种黑兜虫（A. nigriventris Westwood）、小皱蝽同属物种刺桐蝽（C. siccifolia Westwood）的COI碱基序列，序列号分别是JQ387600.1、MG838353.1，简称分别是GB-HDC、GB-CTC。对九香虫、小皱蝽测序获得的碱基序列及GenBank上下载的碱基序列利用MEGA11.0软件进行比对分析，设置bootstrap（1000次重复），构建NJ系统发育树，详见图3。由图可知，九香虫、小皱蝽、黑兜虫、刺桐蝽分别单独聚为一支，九香虫与黑兜虫聚为一大支，小皱蝽、刺桐蝽聚为一大支，这与现代分类亲缘关系一致。说明利用NJ系统发育树不仅能够将四种物种进行准确鉴定，也能够判别物种的亲缘关系，对现代物种分类提供一定的技术支持。

3.5 多重PCR特异性引物检测

将九香虫、小皱蝽的特异性引物分别与对应的模板、混合模板进行PCR扩增，扩增后的产物进行电泳，电泳条带详见图4。单一模板及混合模板分别与对应特异性引物进行扩增，其扩增成功率均为100%。由图可知，九香虫在400～500bp间出现条带，小皱蝽在200～300bp间出现条带，这与九香虫、小皱蝽扩增产物碱基长度为473bp、255bp相对应，说明设计的引物具有特异性。

3.6 多重PCR灵敏度检测

提取按一定比例混合的九香虫、小皱蝽样品总DNA，并分别与单一引物、混合引物分别进行扩增，扩增产物进行电泳，详见图4。九香虫：小皱蝽按1：1、3：1、6：1、9：1混合提取总DNA及扩增产物用A、B、C、D表示，其中B1、C1、D1和E1为混合样品DNA与混合特异性引物扩增产物的条带，B2、C2、D2和E2为混合样品DNA与九香虫的特异性引物扩增产生的条带，B3、C3、D3和E3为混合样品DNA与小皱蝽的特异性引物扩增产生的条带。

由图可知，B1、C1、D1、E1均能产生两条特异性条带，分别是九香虫扩增产物长度473bp和小皱蝽扩增产物长度255bp；B2、C2、D2、E2为单一条带，其长度为473bp，B3、C3、D3、E3为单一条带，其长度为255bp。说明利用多重PCR技术设计特异性引物，其扩增产物通过电泳后，根据电泳条带的有无来判断样品的基原及掺杂情况，鉴定掺杂的比例可达到10%，通过一次提取样品，就能够对样品的基原进行准确鉴定。

3.7 荧光定量PCR单一样品检测

九香虫、小皱蝽分别在与COI引物进行荧光定量PCR反应后，启动熔解曲线程序，九香虫、小皱蝽熔解曲线均为单峰，测得九香虫的Tm值为75℃，小皱蝽的Tm值为89℃。

3.8 荧光定量PCR混合样品灵敏度检测

将混合样品分别按照1：1、3：1、6：1、9：1提取总DNA，向混合DNA加入COI引物，按照荧光定量PCR反应体系及反应程序进行扩增并测定其熔解曲线的Tm值，详见图5。

由图可知，九香虫：小皱蝽按1：1、3：1、6：1、9：1比例混合的样品其Tm值均约为75℃、89℃，而九香虫、小皱蝽单一DNA的Tm值分别是75℃、89℃，说明基于COI引物可以对九香虫掺杂小皱蝽的样品进行准确鉴定，且小皱蝽的Tm值不随样品比例增减而改变，具有很好的操作性及识别度。

4 讨论

九香虫、小皱蝽分别属于蝽科（Pentatomidae stinkbug）九香虫亚科（Dinidoronae）兜蝽属（Aspongopus）、皱蝽属（Cydopelta），为同科不同属的物种，两者亲缘关系相对较远，故可以利用分子鉴定技术对其进行鉴定。通过DNA条形码、多重PCR、熔解曲线分别对九香虫、小皱蝽进行研究，发现均能够对两者进行有效鉴别。其中九香虫、小皱蝽种间遗传距离均大于0.2，说明两者亲缘关系相对较远。二级结构不仅能够对九香虫、小皱蝽进行准确鉴定，种内较少的碱基变异也能够让二级结构发生改变，从而更加直观观察到种内碱基变异。基于COI碱基序列构建的NJ系统发育树能够准确将九香虫、小皱蝽、黑兜虫、刺桐蝽鉴别开且根据聚类树可以对亲缘关系进行判别。

基于多重PCR技术设计九香虫、小皱蝽特异性引物进行扩增，单一模板、混合模板与单一引物进行扩增，均能够得到明亮的单一条带。不同比例的混合模板与混合引物进行PCR扩增时，在小于100bp、400～500bp、200～300bp出现3条电泳条带，其中小于100bp的条带最亮，扩增产物的两条条带均比较暗淡，不同比例的混合模板条带亮度基本一致。不同比例的混合模板与分别与九香虫、小皱蝽特异性引物进行扩增，扩增产物均出现2条条带，小于100bp的条带基本上比目标条带要亮。以上小于100bp的条带均较亮说明在反应过程中出现了引物二聚体，抑制了目的基因进行扩增的速率，导致即使增加模板浓度也不能够进行有效扩增目的基因。混合引物进行扩增时，引物二聚体扩增的效率大大提升，导致混合模板与混合引物进行扩增时，虽然目的基因都能够扩增成功，但目的条带亮度均没有达到引物二聚体、混合模板与单一引物扩增条带的亮度，其中亮度为引物二聚体>单一引物>混合引物。虽然设计的引物有引物二聚体产生，但依然能够有效鉴别九香虫掺杂10%小皱蝽的样品，说明该方法可行，特异性引物有待进一步优化。

基于荧光定量PCR技术对九香虫、小皱蝽进行鉴定，分别与COI引物进行扩增，其熔解曲线Tm值分别为75℃、89℃，但九香虫有一处小峰，Tm值约为66℃，可能为引物二聚体的Tm值，小皱蝽的Tm值峰形较好且无引物二聚体峰。按1：1、3：1、6：1混合模板与COI引物进行扩增时，均出现引物二聚体峰，九香虫的峰形发生较大变化但依然呈现单峰，小皱蝽的峰形保持不变。说明小皱蝽即使模板浓度降低，但其熔解曲线的峰形及Tm值保持不变，利用该方法对九香虫中掺杂小皱蝽的鉴定率可以达到10%的灵敏度，甚至可以有更高的灵敏度。

基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR均能够对九香虫、小皱蝽进行鉴定及鉴别，多重PCR、荧光定量PCR均能够达到10%的灵敏度，对掺杂小皱蝽的九香虫进行准确鉴别，为掺杂一定比例小皱蝽的九香虫鉴定提供一定的思路及方法，为稳定九香虫市场提供一定的技术支撑。

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收稿日期：2022-10-23

通讯作者：许亮（1978-），男，辽宁沈阳人，博士，教授。研究方向：中药鉴定与品质评价。

基金项目：辽宁省“百千万人才工程”资助项目；安徽高校自然科学研究项目（KJ2021A1143；KJ2020A0765）；亳州学院科研项目（BYZ2017C02；BYZXKTD202004；BYH202108）；高校学科（专业）拔尖人才（gxbjZD2020095）