取食Cry3Aa蛋白后黄曲条跳甲成虫中肠组织的病理变化

龚成慧 渠成 魏亦云 王然 罗晨 石旺鹏

摘要

為明确Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的致死效果及作用机理，采用浸叶法测定了黄曲条跳甲成虫取食Cry3Aa蛋白后的死亡情况，并利用透射电镜观察了Cry3Aa蛋白处理后成虫中肠组织的病理学变化。结果显示，取食浓度为2 mg/mL的Cry3Aa蛋白6 d和12 d后黄曲条跳甲成虫的死亡率分别为33.33%和77.78%;透射电镜观察发现，蛋白处理后成虫中肠发生了明显的病理变化，并且随着时间的延长，病理变化更加明显，主要表现为：柱状细胞变形、细胞间隙增大、微绒毛缩短并肿胀、线粒体变形、内质网肿胀。本研究表明黄曲条跳甲成虫中肠是Cry3Aa蛋白的重要作用部位，研究结果为揭示Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的作用机理奠定了基础。

关键词

黄曲条跳甲; Cry3Aa蛋白; 致死效果; 中肠组织; 病理变化

中图分类号：

S 433.5; S 476.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022182

Pathological changes in the midgut of Phyllotreta striolata adults after feeding on Cry3Aa

GONG Chenghui1，2， QU Cheng1， WEI Yiyun1， WANG Ran1， LUO Chen1*， SHI Wangpeng2*

（1. Institute of Plant Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China;

2. College of Plant Protection，China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract

In order to clarify the lethal effect and mechanism of Cry3Aa protein on adults of Phyllotreta striolata，the mortality of adults fed with Cry3Aa protein was determined by leaf dipping method，and the pathological changes of midgut tissue of adults were observed by transmission electron microscopy. The results showed that the mortality rates of adults fed with Cry3Aa protein at 2 mg/mL were 33.33% and 77.78% after six days and 12 days，respectively. Obvious pathological changes were observed in the midgut of adult treated with protein by transmission electron microscopy，and the pathological changes became more obvious with the extension of time，mainly including deformation of columnar cells，enlargement of intercellular space， shortening and swelling of microvilli，deformation of mitochondria and swelling of endoplasmic reticulum. The above results showed that the midgut of P. striolata adults was the important action site of Cry3Aa protein. This study laid a foundation for the mechanism study of Cry3Aa protein on P. striolata adults.

Key words

Phyllotreta striolata; Cry3Aa protein; lethal effect; midgut tissue; pathological change

黄曲条跳甲Phyllotreta striolata属鞘翅目Coleoptera叶甲科Chrysomelidae，是我国十字花科作物的重要害虫，喜食油菜、芥菜、白菜等［12］，以成虫和幼虫取食为害，成虫常聚集在蔬菜叶片背面取食，造成叶片穿孔，影响光合作用，也可取食茎、叶柄、花或顶端分生组织，导致植株萎蔫死亡;幼虫在地下蛀蚀根皮，咬断须根，导致植株萎蔫，还可传播十字花科软腐病，影响经济价值［3］。随着种植结构的调整和设施栽培的推广，其发生为害逐年加重，在广东的为害面积已超过小菜蛾Plutella xylostella。黄曲条跳甲成虫善跳跃，卵、幼虫、蛹土栖，导致防治困难，加之长期不合理的施用化学农药使其产生了极高的抗性。

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）是一种革兰氏阳性细菌，会形成伴孢晶体蛋白［45］，其致病作用依赖于杀虫蛋白，如Cry蛋白［6］。Cry蛋白对靶标昆虫特异性强，对人类、脊椎动物、植物无害，可全部生物降解［7］，是替代化学农药的重要生物防治产品。Cry蛋白在对鳞翅目害虫的防治中已有广泛应用，对鞘翅目害虫防治的应用亦逐渐增多。目前Cry3、Cry5、Cry7和Cry8等Cry蛋白均可用于防治鞘翅目昆虫，但Cry3Aa蛋白效果最好，专一性最强［8］。

Cry蛋白被昆虫摄入中肠肠腔后，会被中肠碱性环境激活，穿过围食膜，与中肠刷状缘膜囊泡（brash border membrane vesicle， BBMV）上的受体蛋白结合，造成细胞穿孔、中肠溶解、昆虫死亡［7， 9］。鳞翅目昆虫幼虫取食Bt蛋白后中肠组织会发生明显的病理学变化。如棉铃虫Helicoverpa armigera取食含 Bt 蛋白（Cry1Ac或 Cry2Ab 或 Vip3Aa）的饲料后，其中肠微绒毛会肿胀、脱落，线粒体和内质网会出现断裂、变形等现象［1012］。鞘翅目昆虫取食Bt蛋白后亦有类似的组织病理变化，如：大黑鳃金龟Holotrichia oblita取食Bt HBF18、FCD114、QDL402等菌株后中肠肠壁细胞出现变形、排列疏松、空洞等现象［13］;暗黑鳃金龟Holotrichia parallela取食Bt菌株HD8E和HD8G后中肠出现微绒毛脱落、细胞间隙增大、内质网肿胀、线粒体变形等现象［14］;黄曲条跳甲取食Bt菌株HA和HD会导致其中肠微绒毛肿胀、底膜脱落［15］。

蘇云金芽胞杆菌菌株G033A于2007年获得国家发明专利授权，于2017年在我国登记用于防治黄曲条跳甲，取食G033A中Cry3Aa蛋白后中肠组织的病理变化尚未见报道。因此，本研究在测定Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫杀虫活性的基础上，利用透射电镜观察了Cry3Aa蛋白对成虫中肠组织造成的病理学影响，为进一步明确Cry3Aa蛋白的作用机制和更好地应用于生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黄曲条跳甲种群采自华南农业大学实验基地，在北京市农林科学院植物保护研究所养虫室内用油菜（品种：‘夏绿2号）饲养2代后取羽化后3 d的成虫试验。饲养温度为（26±1）℃，湿度为（75±5）%，光周期L∥D=16 h∥8 h。

Cry3Aa蛋白购于美延（北京）农业科技有限责任公司;ME204型电子天平，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司;SZM42型体视显微镜，奥斯微光学仪器有限公司;HT7800型透射电子显微镜，日立高新技术公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的致死效果

采用浸叶法测定Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的致死效果。将Cry3Aa蛋白用50 mmol/L Na2CO3溶液稀释成2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL 5个浓度。

选取温室种植的新鲜无虫孔带根的健壮10叶期油菜洗净晾干，油菜去掉嫩心处叶片，仅留最外层2～3片叶，浸叶2 min后自然风干，

每处理3个重复，以不做任何处理的油菜为空白对照。

将上述处理过的油菜单株栽种于育苗盆（上口径90 mm，底径60 mm，高65 mm）中，用封口膜将育苗盆封住（避免昆虫与土壤接触），并在封口膜上扎孔透气，外边罩上一次性塑料瓶，每瓶接入饥饿处理24 h的黄曲条跳甲成虫10头，瓶口用纱布包住。每24 h观察1次黄曲条跳甲死亡情况，连续观察14 d。轻触无明显反应的试虫视为死亡。

1.2.2 成虫中肠组织样品处理及电镜观察

黄曲条跳甲成虫处理方法同1.2.1，处理浓度为2 mg/mL，取样时间为处理后6 d和12 d。用自制吸虫器吸取成虫，每处理取至少3头放入50 mL离心管中，饥饿24 h后置于冰上解剖。用灭菌解剖镊去除成虫足、翅和头部，使成虫背面朝上，沿背侧线轻轻撕开体壁，去除气管、脂肪、肌肉等，取出黄曲条跳甲成虫肠道，截取中肠（中肠位于胃盲囊和马氏管中间）（图1），用1 mL预冷的0.15 mol/L NaCl溶液漂洗3次后，放入固定液中固定2 h。送至中国农业大学生命科学研究中心制作切片（超薄、横切）进行透射电镜观察。

1.3 数据分析

数据采用Excel 2003进行整理，计算校正死亡率，用Graphpad Prism 5作图软件绘制折线图。

死亡率=死亡虫数/处理总虫数×100%；

校正死亡率=（处理组死亡率-空白对照组死亡率）/（1-空白对照组死亡率）×100%。

2 结果与分析

2.1 Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫的致死效果

取食Cry3Aa蛋白后6 d和12 d，黄曲条跳甲成

虫的校正死亡率随着Cry3Aa蛋白浓度的降低而逐渐降低（图2）。处理，2 mg/mL处理后6 d和12 d，成虫校正死

亡率分别为33.33%和77.78%。

2.2 取食Cry3Aa蛋白6 d和12 d后黄曲条跳甲成虫中肠柱状细胞及细胞间隙变化

对照组成虫中肠肠壁柱状细胞形状规整，细胞饱满，内容物多，排列紧密，细胞间隙小或没有细胞间隙（图3a）。Cry3Aa蛋白处理后6 d，细胞出现破裂、变形现象，有部分细胞内容物散入肠腔，细胞排列相对疏松，细胞间隙变大（图3b）。处理后12 d，中肠细胞排列混乱，形态难以辨别，细胞内容物大量散落至肠腔中，细胞间隙大，肠道穿孔（图3c）。

2.3 取食Cry3Aa蛋白6 d和12 d后黄曲条跳甲成虫中肠细胞微绒毛的变化

对照组成虫中肠肠壁柱状细胞顶部的微绒毛细长，数量较多，排列整齐有序（图4a）。Cry3Aa蛋白处理后6 d，成虫中肠微绒毛肿胀变粗，长度明显变短（图4b）。处理后12 d成虫中肠微绒毛同样表现为肿胀、变粗、变短，與处理6 d无明显差异（图4c）。

2.4 取食Cry3Aa蛋白6 d和12 d后黄曲条跳甲成虫中肠细胞线粒体的变化

对照组成虫中肠肠壁柱状细胞线粒体呈椭圆形或纺锤形，轮廓完整，双层膜结构清晰，内脊可见（图5a）。Cry3Aa蛋白处理后6 d，成虫中肠少量线粒体出现变形现象，线粒体被拉长、变细，轮廓相对不完整，但仍然可见双层膜结构（图5b）。处理12 d后，成虫中肠线粒体变形更加严重，线粒体集中且偏向于细胞边缘，或集中散落至肠腔，轮廓不清晰（图5c）。

2.5 取食Cry3Aa蛋白后6 d和12 d黄曲条跳甲成虫中肠细胞内质网的变化

结果如图6所示，对照组成虫中肠肠壁柱状细胞内质网呈扁平囊状，排列整齐（图6a）。蛋白处理后6 d，内质网轮廓不清晰，轻微肿胀，整体上看较为模糊（图6b）。蛋白处理后12 d，内质网肿胀，整体上非常模糊，已无法明确观察到内质网的具体构造（图6c）。

3 结论与讨论

已有研究表明，Cry3Aa蛋白主要对鞘翅目昆虫起作用，如对谷蠹Rhyzopertha dominica［16］和椰心叶甲Brontispa longissima［17］均有较好的致死效果。黄曲条跳甲幼虫在地下为害，成虫取食地上部植物叶片。本试验发现Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲成虫有一定的致死作用，在田间施用Cry3Aa蛋白防治黄曲条跳甲成虫也可有效降低下一代幼虫的数量，从而起到防治效果。

Bt Cry蛋白经昆虫摄入后，在其体内被活化，会与昆虫中肠上皮的靶标结合，造成细胞穿孔，引起昆虫中肠超微结构发生病理学变化，导致昆虫死亡［18］。Sousa等［19］、Cunha等［20］的研究也证明Cry蛋白会造成昆虫中肠的病理学变化，例如中肠细胞变形、细胞间隙增大、微绒毛肿胀变粗、线粒体和内质网肿胀变形。

本研究使用透射电镜观察Cry3Aa蛋白处理后黄曲条跳甲中肠，发现其柱状细胞变形、细胞间隙变大、微绒毛肿胀脱落、线粒体和内质网膨胀变形、边界不清晰。在鳞翅目昆虫中，如棉铃虫［11］、欧洲玉米螟Ostrinia nubilalis［21］、黏虫Mythimna separata［21］、二点委夜蛾Athetis lepigone［22］等昆虫经Cry蛋白处理后其中肠上皮柱状细胞、微绒毛等组织都发生了明显的变化，表现为微绒毛脱落、杯状细胞和柱状细胞变形、边界模糊、线粒体等细胞器变形等病理学变化，本研究得到了类似的结果。但鞘翅目中并无杯状细胞（主要存在于鳞翅目和毛翅目幼虫），因此本研究中所说的细胞变化仅指柱状细胞。在鞘翅目中，Bt菌株HD8E和HD8G对暗黑鳃金龟［14］、 BtHA和BtHD菌株对黄曲条跳甲［15］、 Bt HBF1菌株对铜绿异丽金龟Anomala corpulenta［23］等中肠病理学变化都与本研究结果一致。宋健等的研究发现随着处理时间的延长，昆虫中肠病理变化更加显著且严重，本研究结果也与其一致［23］。以上研究均可证明使用Bt处理不同目的昆虫，都会导致昆虫中肠发生病理学变化，这也验证了Bt蛋白主要作用于昆虫中肠，与昆虫中肠上特异位点结合，相互作用后导致昆虫中肠穿孔这一理论。但本试验仅为对Cry3Aa蛋白对黄曲条跳甲致死作用的初步研究，还需开展进一步分子生物学相关研究，明确Bt Cry蛋白与黄曲条跳甲中肠受体作用机制，为Cry3Aa蛋白的田间应用奠定基础。

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