木霉D5菌株的鉴定及其杀线活性测定

陈瑞莲 毛维兴 刘永红 张树武 徐秉良

摘要

通過形态学和分子生物学方法鉴定了1株杀线木霉D5菌株的种类，并评价了其孢子悬浮液和发酵液对禾谷孢囊线虫Heterodera avenae 2龄幼虫的毒杀活性。结果表明，木霉D5菌株为绿色木霉Trichoderma viride（ITS序列登录号：OL661629;TEF序列登录号：ON241311）。浓度为1.0×107 cfu/mL的D5菌株孢子悬浮液和发酵液原液处理2龄幼虫72 h后，线虫死亡率分别为85.20 %和86.57 %。在温度为20～80℃范围内以及pH为2～10时，发酵液均具有较高杀线活性。

关键词

绿色木霉; 鉴定; 禾谷孢囊线虫; 发酵液; 杀线活性

中图分类号：

S 476

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022184

Identification of Trichoderma strain D5 and determination of its nematicidal activity

CHEN Ruilian1， MAO Weixing1， LIU Yonghong1， ZHANG Shuwu1，2*， XU Bingliang1*

（1. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China; 2. Biocontrol

Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province， Lanzhou 730070， China）

Abstract

The species of Trichoderma spp. D5 strain was identified by morphology and molecular biology methods， and also the nematicidal activity of its spore suspension， fermentation broth were evaluated in the present test. The results showed that the Trichoderma spp. D5 strain was identified as Trichoderma viride （ITS sequence accession number： OL661629; TEF sequence accession number： ON241311）. The mortality of the secondstage juveniles of nematodes were 85.20 % and 86.57 % 72 h after treatment with the concentration of 1.0×107 cfu/mL spore suspension and fermentation broth of D5 strain， respectively. The highest nematicidal activity of fermentation broth was found at the temperature from 20 to 80℃ and the pH value from 2 to 10.

Key words

Trichoderma viride; identification; Heterodera avenae; fermentation broth; nematicidal activity

禾谷孢囊线虫Heterodera avenae 寄主范围广泛，可危害多种禾本科作物及牧草［1］。近年来危害面积不断扩大，已经成为麦类作物的主要病害之一，每年造成经济损失近千亿元［2］。目前，对于禾谷孢囊线虫的防治主要以化学防治为主，但化学农药的大量使用不仅造成环境污染、农药残留，同时造成线虫抗药性逐渐增强。因此，开发高效安全的生物殺线剂是当前研究的主导方向。

木霉是一类广泛存在于土壤中的习居菌［34］。Harman等报道，木霉至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌具有拮抗作用［5］。同时，已有研究表明，多种木霉对线虫具有毒杀和寄生作用，如深绿木霉Trichoderma atroviride、哈茨木霉T.harzianum、绒毛木霉T.tomentosum、绿木霉 T.virens、棘孢木霉 T.asperellum 和长枝木霉 T.longibrachiatum等对植物寄生线虫具有抑制作用，其发酵液对线虫卵和幼虫体壁有消解作用，可抑制或延迟卵孵化，并使幼虫体内空泡化［67］。此外，Siddiqui等［8］利用绿色木霉、哈茨木霉、康氏木霉T.koningii和拟康氏木霉T.pseudokoningii防治爪哇根结线虫Meloidogyne javanica，发现其发酵液能明显降低线虫卵孵化率并提高对2龄幼虫的致死率;马金慧等［9］研究发现哈茨木霉TR12发酵液处理南方根结线虫48 h致死率可达100 %。此外，毛维兴［10］报道了温度和酸碱度等不同外界因子对长枝木霉T.longibrachiatum T6菌株发酵液毒杀禾谷孢囊线虫Heterodera avenae 2龄幼虫的杀线活性具有不同程度的影响;彭双等［11］研究发现温度、酸碱度和储藏时间等不同外界因子对枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis和蜡样芽胞杆菌B.cereus发酵液杀松材线虫Bursaphelenchus xylophilus活性也有不同程度的影响。但是有关本课题组分离的木霉D5菌株的种类及外界因素对其杀线活性影响尚未有报道。

因此，本试验以前期分离的1株木霉D5菌株为研究对象，通过形态学和分子生物学鉴定了其种类，测定了其对禾谷孢囊线虫2龄幼虫的毒杀活性及温度和酸碱度对其杀线稳定性的影响，以便为新型、高效的微生物杀线剂的研制、开发和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

木霉D5菌株由甘肃农业大学植物保护学院植物病毒学和分子生物学实验室分离并保存。供试线虫采自河南省小麦禾谷孢囊线虫发生较严重的地块。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌株D5形态学鉴定

将木霉D5菌株接种于PDA平板上，置于25℃、光周期L∥D=16 h∥8 h的条件下培养2 d后，显微镜下观察其菌丝形态，培养4 d后待其大量产孢时，观察和记录其菌落形态、颜色。同时，在光学显微镜下拍照观察其分生孢子梗和分生孢子形态特征，并测量其分生孢子大小，每个重复随机测量100个分生孢子，共重复3次并取其平均值。

1.2.2 木霉菌株D5分子生物学鉴定

采用CTAB法提取木霉D5菌株基因组DNA，并利用通用引物 ITS1/ITS4和TEFF/TEFR（表1）扩增 ITS和TEF片段，引物合成及PCR产物测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。然后，将测序获得的ITS和TEF序列提交NCBI网站进行BLAST比对分析，利用MEGA 7软件和邻接法构建系统发育树（bootstrap=1 000），确定其分类地位，并结合形态学鉴定结果确定其种类。

1.2.3 木霉D5菌株分生孢子悬浮液和发酵液制备

参考张树武等［12］的方法制备木霉D5菌株分生孢子悬浮液和发酵液。利用血球计数板制备浓度为1.0×104～1.0×107 cfu/mL的分生孢子悬浮液。然后，在PDB培养基 （60 mL，pH=7） 中加入1 mL的1.0×107 cfu/mL D5菌株分生孢子悬浮液，经发酵培养7 d后，4℃，12 000 r/min离心20 min，利用0.22 μm孔径的细菌过滤器去除孢子，即获得无菌发酵液原液，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.4 禾谷孢囊线虫分离及木霉D5菌株杀线活性测定

参考张树武等［13］的方法，采用“漂浮法”分离禾谷孢囊线虫孢囊和2龄幼虫，并利用无菌水配制 （200±10）条/mL的2龄幼虫悬浮液。

参考张树武等［14］的方法，利用96孔细胞培养板测定孢子悬浮液和发酵液的杀线活性，每孔加入10 μL 2龄幼虫悬浮液和90 μL木霉D5菌株孢子悬浮液或发酵液，共5个处理（1.0×104～1.0×107 cfu/mL的分生孢子悬浮液和发酵液原液）和1个对照（无菌水），每个处理和对照均为16个重复。然后，分别置于25℃培养箱并每隔24 h在光学显微镜下统计死亡虫数，连续观察3 d，计算线虫死亡率并进行方差分析。

1.2.5 温度对木霉D5菌株发酵液杀线活性的影响

参考张艳军等［15］的方法略作修改。利用恒温水浴锅将50 mL木霉D5发酵液分别置于20、40、60、80℃和100℃下处理30 min，然后放置冰上待其冷却至室温后参照1.2.4方法测定杀线活性。试验以4℃保存的木霉D5菌株发酵液作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照，每个处理和对照均重复3次。

1.2.6 酸碱度对木霉D5菌株发酵液杀线活性的影响

参考陈超等［16］的方法略作修改。利用盐酸和氢氧化钠分别将木霉发酵液pH调至2、4、6、8、10和12，4℃放置24 h后，再利用盐酸和氢氧化钠调至pH=7后参照1.2.4方法测定杀线活性。试验以4℃保存的木霉D5菌株发酵液作为阳性对照（自然pH），以无菌水作为阴性对照，每个处理和对照均重复3次。

1.3 数据处理

数据采用Excel 2010软件进行统计分析和作图，并采用SPSS 23软件和Duncan氏新复极差法进行多重比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 木霉D5菌株形态学鉴定

木霉D5菌株在PDA平板上培养初期（1～2 d）形成白色绒状菌落，有少量白色气生菌丝，随着培养时间增加，菌落逐渐增大，并在菌落表面产生大量绿色分生孢子。培养4 d后，菌落长满整个平皿，菌落背面中央为绿色。菌丝无色，具有隔膜;分生孢子梗无色，有对生或互生分支，分支角度为锐角或近于直角，在分支顶端形成瓶状小梗，小梗顶端簇生分生孢子;分生孢子多为卵圆形，无色，大小为（2.8×3.5）μm～（2.8×4.2）μm。结合其菌落、菌丝、分生孢子梗和分生孢子形态特征，并参考杨合同主编的《木霉分类与鉴定》［17］，将木霉D5菌株初步鉴定为绿色木霉Trichoderma viride。

2.2 木霉D5菌株分子生物学鉴定

凝胶电泳结果表明，经ITS和TEF引物扩增分别得到大小约为600 bp（图2a）和300 bp的条带（图2b），并经BLAST序列比对发现木霉D5菌株ITS和TEF序列与绿色木霉相似性分别为98.7 %（KY673213.1）和99.83 %（AM498595.1），且ITS（图3）和TEF（图4）分别与绿色木霉（KF881775.1）和绿色木霉（AM498579.1）聚为一支。因此，结合形态学特征和分子生物学检测将木霉D5菌株鉴定为绿色木霉Trichoderma viride（ITS序列GenBank登录号：OL661629;TEF序列GenBank登录号：ON241311）。

2.3 绿色木霉D5菌株孢子悬浮液及发酵液杀线活性测定

不同浓度绿色木霉D5菌株孢子悬浮液和发酵液对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均具有显著的毒杀作用。处理24 h后2龄幼虫开始出现死亡，且随着孢子悬浮液浓度的升高其杀线活性逐渐增强，1.0×107 cfu/mL孢子悬浮液和发酵原液处理72 h时线虫死亡率高，分别为85.20 %和86.57 %，且无显著差异（表2）。

2.4 温度对绿色木霉D5菌株发酵液杀线活性的影响

试验表明，绿色木霉D5菌株发酵液具有较好的温度稳定性，在20～80℃的温度区间均具有较高的杀线活性且与对照相比无显著差异，但当温度继续升高至100℃时，其杀线活性显著降低，处理线虫72 h死亡率为77.74 %，与对照相比降低6.85 %（表3）。

2.5 pH对绿色木霉D5菌株发酵液杀线活性的影响

绿色木霉D5菌株发酵液具有较好的酸碱稳定性，发酵液在pH 2～10条件下处理后，对禾谷孢囊线虫2龄幼虫均具有较好的毒杀作用，处理线虫72 h后死亡率均高于77 %，且与对照相比无显著差异，但是当发酵液在pH 12条件下处理后，其杀线活性显著降低，处理线虫72 h后，线虫死亡率仅为38.96 %（表4）。

3 結论与讨论

木霉作为一种分布广泛的生防菌，其对植物寄生线虫毒杀和寄生作用方面已有相关报道，如张树武等［1819］的研究表明，长枝木霉T6菌株对禾谷孢囊线虫的孢囊、卵及2龄幼虫均具有较高的防治效果，其孢子悬浮液（1.5×107 cfu/mL）处理2龄幼虫72 h后死亡率可达91.3 %，说明木霉在防治禾谷孢囊线虫方面有巨大的应用前景［20］。本试验鉴定了一株对禾谷孢囊线虫2龄幼虫具有较好毒杀作用的绿色木霉D5菌株，发现其发酵液对2龄幼虫的毒杀活性高于孢子悬浮液，并且其发酵液杀线活性在温度和不同酸碱度等因素的胁迫下具有较好的稳定性。

谭可菲等［21］的研究结果表明，不同温度（30～100℃）对生防菌嗜松青霉Penicillium pinophilum SneF8发酵液毒杀南方根结线虫活性无显著影响，24 h后其校正死亡率均大于86 %。本试验中绿色木霉D5菌株发酵液在20～80℃均具有较高的杀线活性，但当温度升高至100℃时，杀线活性降低，这种差异可能是菌株来源以及不同发酵方式引起的。此外，胡红涛等［22］研究发现生防菌弗氏链霉菌Streptomyces fradiae K7发酵液在80℃处理后对黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum和立枯丝核菌Rhizoctonia solani的抑菌效果无显著差异。赵雅等［23］的研究发现，贝莱斯芽胞杆菌B. velezensis HNQ8菌株发酵液在pH 4～10时，具有良好的稳定性，对立枯丝核菌具有较高的抑菌活性，但是强酸性或强碱性环境均会造成其抑菌活性降低，本研究中，绿色木霉D5菌株发酵液具有良好的酸碱稳定性（pH 2～10），这种差异可能是菌株不同造成的。

本研究鉴定了一株具有杀线活性的绿色木霉D5菌株，其发酵液具有较好的杀线活性且在20℃～80℃和pH 2～12时具有杀线稳定性。目前已从木霉菌中提取的杀线活性物质主要有木霉菌素［24］、乙酸［25］和胶酶毒素［26］等，如Yang等［27］研究发现木霉菌YMF1.00416能够产生对秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans具有较强致死作用的挥发性有机物，且其对秀丽隐杆线虫处理48 h后，致死率高达85 %以上。但是，有关绿色木霉D5菌株杀线活性物质鉴定及其杀线作用机制还有待进一步研究。

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（责任编辑：田 喆）