番茄斑驳花叶病毒在广东省的首次报道

汤亚飞 李正刚 佘小漫 于琳 蓝国兵 李战彪 何自福

摘要

番茄斑駁花叶病毒 （tomato mottle mosaic virus， ToMMV）是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种，目前在多国（地区）有发生。本文采用小RNA深度测序及RTPCR检测方法在广东省广州市南沙区辣椒疑似病样中检测到ToMMV，命名为番茄斑驳花叶病毒广东分离物（ToMMVGD2020）。采用RTPCR分段扩增获得了ToMMVGD2020的基因组全序列，该分离物基因组全长6 399 nt，包含4个开放阅读框，分别编码4个蛋白。序列相似性分析表明，ToMMVGD2020与已登录GenBank的14个ToMMV分离物基因组序列相似性分别为99.0%～99.7%，其中与中国辽宁分离物ToMMVLN（GenBank登录号：MN853592）的相似性最高（99.7%），与危害我国番茄、同属烟草花叶病毒属的番茄花叶病毒 （tomato mosaic virus， ToMV）、番茄褐色皱果病毒 （tomato brown rugose fruit virus， ToBRFV）代表分离物的相似性分别为84.6%和81.0%。系统进化分析表明，ToMMVGD2020与该病毒各分离物亲缘关系均较近，与中国辽宁分离物亲缘关系最近。利用ToMMV的PCR特异引物对广东其他6个市采集的67份辣椒疑似病毒病样品进行检测，结果均为阴性，这说明ToMMV目前还是局部危害广东省辣椒。本文是首次报道在广东发现ToMMV，对监测ToMMV在我国的扩散具有重要意义。

关键词

番茄斑驳花叶病毒; 辣椒; 分子鉴定; 病毒基因组序列

中图分类号：

S 436.412.11

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022085

First report of tomato mottle mosaic virus in Guangdong province of China

TANG Yafei1， LI Zhenggang1， SHE Xiaoman1， YU Lin1， LAN Guobing1， LI Zhanbiao2*， HE Zifu1*

（1. Plant Protection Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangdong Provincial Key

Laboratory of High Technology for Plant Protection， Guangzhou 510640， China; 2. Plant Protection Research

Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Guangxi Key Laboratory for Biology of Crop Diseases and

Insect Pests， Nanning 530007，China）

Abstract

Tomato mottle mosaic virus （ToMMV） was a novel species belonging to Tobamovirus genus discovered in 2013. At present， ToMMV has occurred in many countries （regions）. In this paper， ToMMV was detected in disease pepper samples collected from Nansha district， Guangzhou city， Guangdong province， using small RNA deep sequencing and RTPCR techniques. The isolate was named as tomato mottle mosaic virus Guangdong isolate （ToMMVGD2020）. The whole genome sequence of ToMMVGD2020 was obtained by RTPCR. The whole genome of this isolate was 6 399 nt in length and contained four open reading frames， encoding four proteins， respectively. The whole genome sequence of ToMMVGD2020 shared 99.0%-99.7% nt identities with other isolates of ToMMV deposited in GenBank， with the highest nt identity to the isolate Liaoning （GenBank accession number： MN853592） at 99.7%， shared 84.6% and 81.0% nt identities with tomato mosaic virus （ToMV） and tomato brown rugose fruit virus （ToBRFV）， which belonged to the genus Tobamovirus， respectively. Phylogenetic analysis showed that ToMMVGD2020 shared more relationship with each of ToMMV isolates， and the closest relationship with Liaoning isolate of ToMMV. ToMMV was not detected in 67 diseased pepper samples collected from other six cities in Guangdong province. The result indicated that ToMMV infected peppers locally in Guangdong province. This is the first report of ToMMV in Guangdong province， which is great significance for monitoring the spread of ToMMV in China.

Key words

tomato mottle mosaic virus; pepper; molecular identification; virus genome sequence

辣椒Capsicum annuum L.是一种重要蔬菜作物和调味品。据国家大宗蔬菜产业技术体系统计，近年来辣椒种植面积稳定在210万hm2以上，占全国蔬菜总播种面积的9.28%，已成为种植面积最大的蔬菜作物［1］。病毒病是辣椒生产上的主要病害，在全球各辣椒产区普遍发生，严重影响辣椒的产量与品质。广东省是我国辣椒生产大省之一，年种植面积约10万hm2，其中冬种面积超过70%。病毒病每年给广东辣椒生产造成不同程度的损失，危害辣椒的病毒种类众多，世界各地已报道危害辣椒的病毒有70种以上，而我国发现至少有37种［2］。关于危害广东辣椒的病毒种类，前人利用鉴别寄主、血清学及RTPCR等技术从广东辣椒病样中检测到黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus， CMV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus， TMV）、马铃薯Y病毒（potato virus Y， PVY）等13种［36］。本团队利用小RNA深度测序及RTPCR检测技术，鉴定出侵染广东辣椒的病毒有14种，分别为CMV、TMV、PVY、辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus， PMMoV）、甜椒内源RNA病毒（bell pepper endornavirus， BPEV）、烟草轻型绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus， TMGMV）、辣椒脉斑驳病毒（chilli veinal mottle virus， ChiVMV）、辣椒黄脉病毒1 （pepper vein yellow virus 1， PeVYV1）、甜椒斑驳病毒（pepper veinal mottle virus， PVMV）、辣椒环斑病毒（chilli ringspot virus， ChiRSV）、辣椒黄脉病毒6 （pepper vein yellow virus 6， PeVYV6）、辣椒褪绿病毒（capsicum chlorosis virus， CaCV）、蚕豆萎蔫病毒2号（broad bean wilt virus 2， BBWV2）、辣椒隐症病毒1 （pepper cryptic virus 1， PCV1），且复合侵染很普遍［7］。

番茄斑驳花叶病毒tomato mottle mosaic virus（ToMMV）属植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒屬Tobamovirus成员，是一种（＋）ssRNA病毒，基因组全长约为6.4 kb，主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物，引起植株表现斑驳、花叶、生长缓慢等症状，严重影响产量和品质。ToMMV最先发现于墨西哥番茄上［8］，随后在中国［910］、美国［11］、以色列［12］、西班牙［13］、巴西［14］等国家也相继报道发现该病毒危害番茄、辣椒。在我国，最先发现危害云南的辣椒［9］，截至目前，海南、云南、湖南、辽宁、山东、河南、河北、陕西、西藏和内蒙古等省（自治区）的番茄、辣椒、茄子等茄科作物已受到该病毒的危害，该病毒已在我国扩散和流行，极有可能成为危害茄科作物的主要病毒之一［1516］。目前，GenBank数据库中已登录有来自墨西哥、美国、巴西、荷兰、西班牙和中国6个国家的14个ToMMV分离物的全基因组序列，包括来自中国海南和辽宁的2个番茄分离物、云南和西藏的2个辣椒分离物全基因组序列。

2020年，作者团队对危害广东省辣椒的病毒种类进行监测与鉴定，首次在广州市南沙区辣椒病样中检测到ToMMV，进一步对ToMMV广东分离物的全基因组进行了克隆与序列分析，同时对广东省其他地区辣椒病样进行分子检测，以期监测该病毒并为该病毒病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试样品：2019年-2021年，从广东省辣椒产区采集田间表现花叶、斑驳、环斑、皱缩、褪绿等症状疑似病毒病的辣椒叶片样品77份，其中湛江19份、茂名9份、韶关16份、肇庆8份、河源7份、佛山8份、广州10份，置于-80℃冰箱保存待用。

主要试剂和仪器：植物RNA提取试剂RNAiso Plus、反转录试剂盒（PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit）、Premix TaqTM （Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）和pMD 19T Vector购自宝生物工程（大连）有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒（GeneJET Gel Extraction Kit）购自美国Thermo赛默飞公司;大肠杆菌Escherichia coli T1化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;T100TM Thermal cycler PCR仪、Universal HoodⅡ凝胶成像系统以及电泳仪均购自美国BIORAD公司;植物组织自动研磨仪MM400购自德国Retsch（莱驰）公司。

1.2 小RNA深度測序和分析

对2020年6月从广东省广州市南沙区万顷沙镇采集的10份辣椒病叶混合成2份样品进行小RNA深度测序。采用TRIzol方法提取待测样品总RNA，构建满足Illumina平台测序的小RNA文库，通过Illumina nextseq 500测序仪进行深度测序;应用Cutadapt［17］和质量分数预处理方法对原始数据进行去除接头序列等预处理，然后对预处理后的数据采用SPAdes［18］拼接;利用BLAST程序将拼接序列与GenBank数据库中的已知病毒基因组序列进行相似性比对，根据相似性结果初步判断样品中存在的病毒。上述深度测序和分析由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 RTPCR扩增验证

根据小RNA深度测序获得病毒序列，应用引物在线设计网站（http：∥primer3.ut.ee/）设计引物，检测ToMMV的引物为ToMMVF：5′CACGCAGAACTACGCTGCGTTGTCCG3′，ToMMVR：

5′CCGGACAACTCAGGTGAATTAAAGTTC3′，扩增的目的片段大小为807 bp;检测PVMV的引物为PVMVF：

5′GGTTTGGTGTATAGAAAATGGG3′，PVMVR：5′CAGACTCTATCAGGTGGTATAAC

3′，

扩增的目的片段大小为758 bp;检测ToMV的引物为ToMVF：5′AAACCGCTTTTTAGCGGCAG3′，ToMVR：5′TATTAATGAGTTTATC

GATCTGTC3′，扩增的目的片段大小为322 bp;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以用于小RNA深度测序的单个病样为模板，采用Trizol法分别提取10份待测辣椒病叶的总RNA，进一步用随机引物（大连TaKaRa公司）逆转录合成cDNA，反应体系和具体方法按照试剂盒说明书操作，然后利用所设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系：反转录合成cDNA 1 μL，ExTaq PCR MIXER 25 μL，10 μmol/L的上、下游引物各2 μL，加灭菌水至总体积50 μL。反应程序为：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃ 10 min。根据扩增产物的大小和产物直接测序结果确定病样中的病毒种类。

1.4 病毒基因组全长的扩增与测定

通过对登录在GenBank数据库中14条ToMMV全基因组序列进行对比，设计4对覆盖全基因组的引物（表1）。以小RNA深度测序与RTPCR相结合确定存在ToMMV的样品cDNA为模板，利用所设计覆盖ToMMV全基因组4对引物分别进行PCR扩增（图1）。PCR反应体系同1.3，反应程序为： 94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。应用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，纯化后连接到pMD19T载体，并转化大肠杆菌T1感受态细胞。在含100 μg/mL Amp、40 μL/mL Xgal的LB固体培养基上37℃倒置培养过夜;每个平板随机挑取3个阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 病毒基因组全长序列分析

利用DNAStar软件的SeqMan对所获得的基因序列进行拼接，获得ToMMV基因组全长序列，利用BLAST程序在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，并从GenBank数据库下载已报道的14个ToMMV分离物及危害我国番茄且同属于烟草花叶病毒属的番茄花叶病毒（tomato mosaic virus， ToMV）、番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus， ToBRFV）代表分离物的全基因组序列，用DNAStar的MegAlign进行序列比较分析，采用MEGA 6.06的邻接法（neighbor joining，NJ）构建进化树，bootstrap检验1 000次。

1.6 其他地区病样的检测

利用扩增ToMMV的引物ToMMVF/ToMMVR对2019年-2021年从广东省其他地区采集的67份辣椒病样进行RTPCR检测，反应体系和反应程序同1.3。根据PCR检测确定ToMMV在广东地区的分布。

2 结果与分析

2.1 小RNA深度测序以及RTPCR验证结果

2020年6月从广东省广州市南沙区采集田间表现花叶、斑驳、叶片皱缩、轻微丛生等典型病毒病症状的辣椒样品10份（图2），将其混合成2份样品进行小RNA深度测序。结果显示，样品1共获得17 474 690条reads，除杂后为2 921 707条reads，拼接获得179个contigs;经与GenBank数据库中报道的病毒序列进行比对，其中有14条比对到ToMMV，相似性均高于94%～100%，长度为144～1 183 bp，11条比对到ToMV，相似性在97%以上，长度为111～322 bp，6条比对到PVMV，相似性在97%以上，长度为549～4 261 bp。样品2共获得16 853 953条reads，除杂后为4 835 767条reads，拼接获得468个contigs;经与GenBank数据库中报道的病毒序列进行比对，其中有7条比对到ToMMV，相似性在99%，长度为153～2 529 bp，9条比对到PVMV，相似性在97%以上，长度为235～2 261 bp。测序结果初步表明，广东广州南沙辣椒病叶混合样品中可能含有ToMMV、ToMV、PVMV 3种病毒。

2.2 RTPCR验证小RNA深度测序结果

利用根据小RNA深度测序获得病毒序列所设计的检测ToMMV、ToMV和PVMV特异引物，对广东省广州市南沙区万顷沙镇2份混合样品的10份单个样品分别进行RTPCR检测，结果显示：ToMMV、ToMV和PVMV特异引物能从不同的单株病样中扩增出预期大小的目的条带（图3），其中1份病样为ToMV单独侵染，1份病样为ToMV和PVMV复合侵染，2份病样为ToMMV和PVMV复合侵染，5份样品为3种病毒复合侵染，还有1份病样未检测到这3种病毒。PCR产物测序结果表明，上述3个特异片段分别是对应病毒ToMMV、ToMV和PVMV的基因片段。因此，引起广东省广州市南沙区辣椒病毒病的病原至少有ToMMV、ToMV和PVMV 3种病毒，且以复合侵染为主。

2.3 ToMMV广东分离物的基因组结构

以小RNA深度测序和RTPCR检测验证确定含有ToMMV的病样总RNA为模板，利用设计覆盖全基因组的4对引物进行分段PCR扩增，均能扩增出预期大小的目的片段（图4），克隆、测序分析获得大小分别为1 693、1 717、1 687、1 694 bp的4条片段，进一步通过拼接获得ToMMV广东分离物（ToMMVGD2020）基因组全序列大小为6 399 nt（GenBank登录号：OK180812），包含4个开放阅读框，分别编码复制相关蛋白（76-3 426 nt）、复制酶蛋白（76-4 926 nt）、运动蛋白（4 910-5 716 nt）、外壳蛋白（5 719-6 198 nt）。

2.4 ToMMV广东分离物的基因组全长序列分析

BLAST结果显示，与ToMMVGD2020基因组全序列具有较高相似性的序列均为ToMMV分离物。采用MegAlign的Clustal W方法比较结果表明（表2），ToMMVGD2020与登录GenBank的ToMMV 14个分离物全基因组核苷酸序列相似性为99.0%～99.7%，其中与中国辽宁分离物ToMMVLN（GenBank登录号：MN853592）的相似性最高，为99.7%，而与危害我国番茄、同属烟草花叶病毒属的ToMVSGZZ（GenBank登录号：KY967221）、ToBRFVSD（GenBank登录号：MT018320）的相似性分别为84.6%和81.0%。

對ToMMVGD2020、已登录GenBank的14个ToMMV分离物、ToMVSGZZ和ToBRFVSD的全基因组序列构建系统进化树，结果显示（图5），ToMMVGD2020与来自墨西哥、中国、美国、巴西、荷兰、西班牙6国的14个ToMMV分离物聚集在一个大分支上，其中与来自中国辽宁的LN分离物聚集在一个小分支，二者亲缘关系最近，而与危害我国番茄的同属病毒ToMVSGZZ和ToBRFVSD亲缘关系较远。

2.5 广东其他地区辣椒疑似病毒病样品检测结果

利用ToMMV的检测引物ToMMVF/ToMMVR对2019年-2021年从广东省湛江、茂名、韶关、肇庆、河源、佛山6个市采集的67份辣椒病样进行RTPCR扩增，均未扩增出目的片段，该结果初步表明ToMMV目前是在局部地区危害广东省辣椒。

3 结论与讨论

本文应用小RNA深度测序与RTPCR检测相结合的方法在广东辣椒病样中检测到ToMMV，该病毒分离物基因组全长为 6 399 nt，与国际上已报道的14个ToMMV分离物基因组核苷酸序列相似性均超过99.0%，但在广东7个市辣椒产区病样中仅广州市南沙区检测发现该病毒。这是在广东首次发现该病毒。

ToMMV是2013年发现的烟草花叶病毒属一个新种，目前已在多国有发生和分布。在我国，2014年首次在辣椒上检测到该病毒，目前在我国至少10个省（自治区）已有发生，可见该病毒扩散速度快，存在发生流行的趋势［16］。2013年-2016年，本团队利用小RNA深度测序技术对侵染危害广东辣椒的病毒进行调查与鉴定，从广东各地采集的辣椒病样中检测到14种病毒，但未检测到ToMMV［6］。此后，本团队持续监测辣椒病毒病发生动态。2020年，在广州市南沙区辣椒产区病样中检测到ToMMV，说明ToMMV已扩散传播到广东省，并危害辣椒。

本文采用分段扩增、克隆获得了ToMMV广东分离物的基因组全长序列，该序列与国际上已报道的ToMMV各分离物间相似性均在99.0%以上;同时，ToMMV各分离物基因组序列相似性也均在99.0%以上，说明该病毒高度保守。这对开展抗病资源筛选与抗病品种选育十分有利。

ToMMV可通过汁液摩擦传播，也可通过种子带毒传播［19］。该病毒自然条件下可侵染番茄、辣椒等茄科作物;人工接种条件下除茄科作物外，还可以侵染葫芦科、豆科、十字花科等多种作物，且致病性比同属的TMV更强，接种植株症状更严重［20］，而且ToMMV比ToMV的寄主范围更广，侵染性更强［21］。可见，ToMMV的潜在危害性很大。2014年首次在云南辣椒上检测到该病毒以来，ToMMV目前已在我国多个省（自治区）发生，呈现流行与扩散的趋势，很有可能将成为危害我国蔬菜作物的主要病毒。本研究仅在广东省广州市南沙区辣椒上检测到ToMMV，至于其是否危害其他作物及扩散动态，还有待于进一步监测。

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（責任编辑：田 喆）