白斑综合征病毒(WSSV)灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV的研究

裘杰珂，赖勇勇，许英蕾，朱 斐

（浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300）

白斑综合征病毒(WSSV)是线头病毒科Nimaviridae 白斑病毒属Whispovirus的唯一成员[1]。在电子显微镜下可以观察到WSSV 的核衣壳呈棒状，核衣壳表面有3 层膜交叉覆盖，并形成阴影，核衣壳的一端还有一个独特的尾状结构。WSSV 的核衣壳由14 个环组成，其中包含1 个约300 kb 的圆形dsDNA 基因组[2]，是迄今为止被完全测序的最大动物病毒之一[3]。在养殖条件下，感染WSSV 的虾类可在3～10 d内死亡[4]。另外，WSSV 还会感染其他甲壳类动物，其中就包括克氏原螯虾Procambarusclarkii[5-6]。WSSV 危害大、传播快，已对中国虾类养殖业造成了数十亿美元的经济损失。然而常规的化学和物理方法并不能有效地控制WSSV 对虾类的感染。因此，找到并采取合理的预防手段才是控制该病毒病的关键。有关物理和化学消毒方法对WSSV 的灭活作用已有较多报道[7-10]，已确定了温度、紫外线、pH、臭氧、盐度、干燥和化学消毒剂等因素对WSSV 灭活的影响。有研究发现：大部分化学试剂对WSSV 灭活后，WSSV 的免疫原性会受到损害[7,9-11]，而双乙烯亚胺(BEI) 对免疫原性的损害相对较小，因此BEI 是对含有DNA 或RNA 基因组动物病毒的首选灭活剂[12-14]。基于此，本研究从WSSV 灭活制剂着手，用BEI 灭活WSSV，通过口服和注射途径分别建立克氏原螯虾的主动免疫体系，再对其进行抗WSSV 感染的效果研究，分析WSSV 灭活制剂对WSSV 的防治效果，为防治WSSV 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组

LAI 等[15]研究可知：超声破碎WSSV 后获得的蛋白质和核酸可以感染克氏原螯虾并导致其死亡，其有效性与完整的WSSV 病毒一样。因此，本研究对病毒进行超声破碎，之后进行BEI 灭活，观察BEI 灭活制剂是否具有与超声破碎制剂相同的抗WSSV 效果。本研究分为口服和注射免疫，免疫7 d 后再进行WSSV 攻毒感染。具体分组如表1所示。克氏原螯虾购于安徽宣城，养殖于充气水箱中，水温为25 ℃，每日投喂克氏原螯虾专用饲料。

1.2 超声破碎WSSV

取经过WSSV 感染的克氏原螯虾的尾部肌肉，参考ZHU 等[16]的方法提纯WSSV。使用高速分散器将WSSV 提纯液快速分散呈匀浆，用超高速冷冻离心机在6 000g下离心10 min，分离上清液后再次离心，重复3 次。离心完成后，肌肉组织已基本去除，WSSV 病毒存在于上清液中。将上清液通过300 目细胞筛过滤分散后，用离心机在6 000g下离心30 min。再将分离出的上清液通过450 nm的滤膜后，用离心机在30 000g下离心30 min，最后得到WSSV 病毒粒子的白色沉淀。将提取到的病毒粒子用10 mL 磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶解后，使用FS 200 T 超声波均质机(上海盛溪)破碎溶解的病毒颗粒。破碎完成后，在30 000g条件下对超声破碎的病毒粒子离心30 min，离心得到的上清液便是WSSV 病毒粒子的破碎液，使用100 nm 滤膜进行过滤，即为WSSV 超声破碎液。

1.3 BEI 灭活WSSV 破碎液

将0.12 mol·L-1BEI 溶液按1∶60 的体积比加入到病毒液中，使BEI 的最终分子浓度为2 mmol·L-1。在37 ℃下恒温灭活3 个不同时间段(1、12、24 h)的病毒液，期间每2 h 搅拌1 次。经过规定时间后，剩余BEI 以50∶1 的体积比例加入质量分数2% 的硫代硫酸钠使灭活中止，制成WSSV 灭活制剂。每100 mL WSSV 灭活制剂中含45 mg WSSV 粒子，WSSV 灭活制剂中WSSV 的质量浓度为0.45 g·L-1。

1.4 免疫攻毒实验

克氏原螯虾养殖于(25±1) ℃控温玻璃缸中，随机分成10 组，每组20 只，每组设3 个重复，投喂配合饲料暂养7 d。将WSSV 超声破碎液与饲料混合均匀，混合5 min 后用蜂胶液包被，风干10 min 后投喂受试克氏原螯虾。将WSSV 提纯液与克氏原螯虾饲料混合均匀，混合5 min 后用蜂胶液包被，风干10 min后投喂受试克氏原螯虾。7 d 后所有实验组进行攻毒研究，期间保证每组克氏原螯虾摄食等量的饲料，同时记录每日死亡率。

2 结果与分析

从表2可见：经BEI 处理WSSV 24 h 后，注射和口服免疫克氏原螯虾的死亡率为0，说明没有感染性；而BEI 灭活WSSV 破碎处理液1 h 的注射死亡率为100.0%，口服死亡率为10.0%，BEI 处理12 h的注射死亡率为33.3%，口服死亡率为0，说明口服免疫更安全，注射免疫危险性比较高，但是BEI 处理时间过短也会使病毒没有完全灭活，因此BEI 灭活24 h 较为安全，后续实验均采用BEI 灭活WSSV 破碎液24 h 的制剂。

表2 BEI 灭活WSSV 感染克氏原螯虾的死亡率Table 2 Mortality of P. clarkii infected with BEI-inactivated WSSV

从表3可见：WSSV 无论是通过口服感染还是注射感染，死亡率均为100%。用BEI 灭活WSSV破碎液1 和12 h 分别采用注射或口服免疫克氏原螯虾，虽然免疫过程中死亡了一些，但将活着的克氏原螯虾7 d 后攻毒，口服的存活率为30%～40%，注射的效果较差，最后的存活率为20%(图1)。以上结果说明灭活时间延长后，不但灭活更完全，而且灭活制剂的保护效果更好，因此在后续的研究中采用了24 h 的灭活时间。用BEI 灭活WSSV 破碎液24 h制成灭活制剂，采用注射或口服免疫克氏原螯虾7 d后分别注射、口服攻毒，结果发现WSSV 灭活制剂的口服免疫效果明显，比起注射WSSV 组和口服WSSV 组的100% 死亡率，注射免疫的克氏原螯虾在攻毒后存活率为40%，口服免疫的存活率为50%(图2)；经灭活制剂免疫7 d 后，再去感染WSSV，极大地降低了死亡率，免疫效果比较明显。

图1 BEI 灭活WSSV 破碎液免疫7 d 后攻毒克氏原螯虾的存活率Figure 1 Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

图2 BEI 灭活WSSV 制剂免疫7 d 后攻毒克氏原螯虾的存活率Figure 2 Survival rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV immunization

表3 BEI 灭活WSSV 制剂免疫7 d 后攻毒克氏原螯虾的死亡率Table 3 Mortality rate of P. clarkii after 7 days of BEI-inactivated WSSV (ruptured ultrasonically) immunization

3 讨论与结论

已有研究表明：WSSV 囊膜蛋白可以诱导甲壳动物对WSSV 产生抵抗力，从而大幅提高WSSV 攻毒后的成活率；多糖(如葡聚糖、壳聚糖、甲壳素)也被认为能提高甲壳动物的免疫力，并被广泛用于提高甲壳动物抗细菌性和病毒性疾病的研究[6-8]。由BEI 灭活的WSSV 灭活制剂，可以保护WSSV 囊膜蛋白的完整性[16]，使其免疫原性最大限度不受破坏。

本研究表明：用BEI 灭活的WSSV 灭活制剂免疫接种克氏原螯虾7 d 后，可在一定程度上保护克氏原螯虾免受WSSV 的侵害。克氏原螯虾对WSSV 非常敏感，通过口服和注射途径的克氏原螯虾死亡率都超过90%[17]。在本次研究中，随着灭活时间的延长，注射和口服2 mmol·L-1BEI 灭活WSSV 制剂的克氏原螯虾存活率越来越高，说明只要灭活时间足够，使用BEI 灭活的WSSV 灭活制剂可以成功地保护克氏原螯虾免受WSSV 的侵害。NAMIKOSHI 等[11]使用甲醛灭活的WSSV 也获得了类似的结果，受免疫保护的对虾Penaeusjaponicus在WSSV 攻毒实验中存活率显著升高。同样，紫外线灭活的WSSV对日本对虾Marsupenaeusjaponicus也有一定的免疫保护效果[18]。这就引发了甲壳动物中是否存在免疫记忆的猜想[19]，但要证实其中的免疫机制还有待更深入的研究。

综上所述，BEI 灭活的WSSV 免疫克氏原螯虾的效果十分明显，并且口服免疫的保护效果优于注射免疫。与BEI 的灭活纯病毒液24 h 相比，BEI 灭活的WSSV 破碎液减少了灭活时间，但最终也是口服免疫的效果较好。用BEI 灭活的WSSV 灭活制剂饲喂克氏原螯虾后，可以有效地降低克氏原螯虾感染病毒的死亡率，说明用BEI 灭活的WSSV 灭活制剂对克氏原螯虾抗WSSV 具有保护性效果，可成为抗白斑综合征的一种免疫策略。

4 致谢

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