羌药五转七质量标准研究

沙梦香 李聪颖 张艺 张静

【摘要】目的：針对羌药五转七现行标准缺乏问题，对五转七药材进行质量标准研究。方法：对五转七药材进行性状、显微及薄层色谱（TLC）定性鉴别；按《中华人民共和国药典（2020年版）》（四部）通则方法检查药材中的水分、总灰分、酸不溶性灰分，测定醇溶性浸出物的含量；采用HPLC法，以獐牙菜苷、马钱苷酸、绿原酸为指标，建立多成分含量测定方法。结果：10批五转七药材有相似的性状及显微特征；薄层色谱斑点清晰，分离度好；10批五转七药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物含量分别为6.71%～9.36%、2.59%～6.56%、0.64%～2.59%、8.37%～13.55%；獐牙菜苷、马钱苷酸、绿原酸线性关系范围分别在101.05～606.3 μg·mL-1、26.9～323.7 μg·mL-1、5.06～101.2 μg·mL-1 （r=0.9995、r=1.0000、r=0.9999）线性关系良好，仪器精密度、重复性、稳定性、加样回收率的RSD值均符合要求；3种成分含量分别为0.0172%～0.0611%、0.0043%～0.0405%、0.0956%～0.2234%。结论：基于研究结果，初步拟定羌药五转七中水分、总灰分、酸不溶性灰分分别不得过10.0%、7.0%、3.0%，醇溶性浸出物不得低于8.0%，獐牙菜苷的含量不得低于0.10%。

【关键词】羌药五转七；质量标准；显微鉴别；TLC；HPLC；含量测定

【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）10-0028-06

Study on  Quality Standard of Qiang Medicine WuzhuanqiSHA Mengxiang1，2LI Congying1，2ZHANG Yi1，2*ZHANG Jing1，2

1.School of Ethnic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；

2.Academic Inheritance and Innovation Research Center of Ethnic Medicine，Chengdu University

of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，ChinaAbstract：Objective Aiming at the lack of the current standard of Qiang medicine “Wuzhuanqi”， study on the quality standard of Wuzhuanqi.Method To identify the characters， microscopic and TLC of Wuzhuanqi medicinal materials; According to the general principles of Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （2020 Edition） （Part IV）， check the water， total ash and acid-insoluble ash in medicinal materials， and determine the content of alcohol-soluble extract; HPLC method was used to establish a multi-component content determination method with swertiamarin， loganin and chlorogenic acid as indicators.Result Ten batches of Wuzhuanqi medicinal materials have similar characters and microscopic characteristics; Thin-layer chromatographic spots are clear and the resolution is good; The contents of water， total ash， acid-insoluble ash and alcohol-soluble extract in 10 batches of Wuzhuanqi were 6.71%-9.36%，2.59%-6.56%， 0.64%-2.59% and 8.37%-13.55% respectively.The linear relationships of swertiamarin， loganic acid and chlorogenic acid were 101.05-606.3 μg·mL-1， 26.9-323.7 μg·mL-1 and 5.06-101.2 μg·mL-1（r=0.9995，r=1.0000，r=0.9999），respectively.The contents of three components are 0.0172%-0.0611%， 0.0043%-0.0405%， 0.0956%-0.2234% respectively.Conclusion Based on the results of this study， it is preliminarily determined that the water content， total ash content and acid-insoluble ash content of Qiang medicine Wuzhuanqi should not exceed 10.0%， 7.0% and 3.0% respectively， the alcohol-soluble extract should not be lower than 8.0%， and the content of Swertiamarin should not be lower than 0.10%.

Keywords：Qiang Medicine Wuzhuanqi; Quality Standards; Microscopic Identification; TLC; HPLC; Content Determination

五转七是羌族地区常用的民族药，羌语为“mo te be”，音译为“莫喆·補惹”，也称“吾落哈”，为忍冬科植物穿心莛子藨Triosteum himalayanum Wall.的干燥全草。夏、秋二季采挖，除去杂质，洗净，晒干用［1］。性寒，味苦，具有利尿消肿、理气活血、调经的功效，主治小便不通、浮肿、月经不调、劳伤疼痛等［2］。在羌医药临床应用中，五转七与其他草药配伍常用于治疗“筋骨疼痛，跌打损伤”。五转七始载于《陕西中草药》（异名：包谷花、钻子七、包谷陀子、达对月草）［3］，在《羌族医药》［1］《中国民族药辞典》［2］《中国植物志》［4］《中华本草》［5］《全国中草药汇编》［6］中均有记载。

目前未有相关标准收载五转七，缺乏质量控制；文獻研究方面只对其化学成分进行了研究，环烯醚萜类、黄酮类、三萜类、甾体类、香豆素类、糖类等化学成分为其主要活性成分［7-8］。基于此，在“四川省药品监督管理局中药（民族药）标准提升”项目中增加了五转七质量标准，以期对该药材的质量进行全面控制。

1仪器与材料

1.1仪器 岛津2030型高效液相色谱仪、DHG-9145A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、FA1004型万分之一分析电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）、BSA124S型十万分之一分析电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］、SB-8200DTS型双频超声仪（宁波新艺超声设备有限公司，功率 400 W，频率 40 kHz）、UPH-I型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

1.2药品与试剂 五转七药材采自四川甘孜州、阿坝州等地，经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定为忍冬科植物穿心莛子藨Triosteum himalayanum Wall.的干燥全草，其信息来源详见表1。马钱苷酸对照品（批号PS010047，纯度≥98.5%）、绿原酸对照品（批号PS010694，纯度≥98.5%）、獐牙菜苷对照品（批号PS010483，纯度≥99%），均购自成都普思生物科技股份有限公司，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1性状鉴别 本品根状茎呈不规则团块状，表面棕褐色，密生茎痕及疣状突起。主根不明显，侧根较多，密生须根，表面棕褐色，外表皮易脱落，皮层呈浅黄棕色，不易折断。茎表面红棕色，被毛，易折断，断面中空。叶多皱缩，灰绿色，上表面被白色长刚毛，下表面脉上毛较密。偶见核果，卵形，表面黑棕色或黄棕色，被毛。如图1、图2所示。

2.2显微鉴别 本品粉末为棕褐色。淀粉粒团多；导管常见，螺纹导管和孔纹导管交互存在；非腺毛较多，单细胞，多碎断，呈柱形；草酸钙簇晶常见，独立存在或聚集在一起。如图3所示。1.非腺毛;2.导管;3.草酸钙簇晶;4.淀粉粒团

2.3TLC鉴别 取10批五转七药材粉末1 g，加入甲醇25 mL，超声（功率400 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，滤过，滤液干，用3 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。另取对照品熊果酸适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502），吸取上述供试品溶液3 μL和对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲烷-冰醋酸（20∶8∶5∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点清晰，分别置日光和紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点。如图4所示。

2.4检查 考虑到药材来源的差异，本研究水分、总灰分和酸不溶性灰分以略高于最高测定值设限，醇溶性浸出物、含量测定以略低于最低测定值设限［10］。

2.4.1水分 取10批五转七药材粉末适量，精密称定，按2020年版《中国药典》［9］（四部）“通则0832水分测定法”项下 “烘干法”进行测定，每批平行3次，取平均值。结果，10批五转七药材的水分含量为6.71%～9.36%，初步拟定限度不得过10.0%。五转七药材中水分测定结果见表2。

2.4.2总灰分和酸不溶性灰分 取10批五转七药材粉末适量，精密称定，按2020年版《中国药典》［9］（四部）“通则2302灰分测定法”项下总灰分和酸不溶性灰分测定法进行测定，每批平行3次，取平均值。结果，10批五转七药材的总灰分含量为2.59%～6.56%，规定限度不得过7.0%；酸不溶性灰分含量为0.64%～2.59%，初步拟定限度不得过3.0%。五转七药材中总灰分和酸不溶性灰分测定结果见表2。

2.4.3醇溶性浸出物测定 取10批五转七药材粉末各约2 g，按2020年版《中国药典》［9］（四部）“通则2201浸出物测定法”项下醇溶性浸出物测定法（热浸法）进行测定，溶剂为50%乙醇，每批平行3次，取平均值。结果，10批五转七药材醇溶性浸出物的含量为8.37%～13.55%，根据测定结果，初步拟定限度不得少于8.0%。五转七药材中醇溶性浸出物测定结果见表2。

2.5马钱苷酸、绿原酸和獐牙菜苷含量测定

2.5.1混合对照品溶液的制备 取马钱苷酸、绿原酸、獐牙菜苷对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶，加甲醇定容，制成上述3个成分质量浓度分别为0.678 mg·mL-1、0.630 mg·mL-1、1.176 mg·mL-1的混合对照品贮备液。置4 ℃冰箱中保存，备用。

2.5.2供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.3色谱条件 色谱柱：赛默飞Hypersilgold C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）—0.4%磷酸水溶液（B）；梯度洗脱（0～22 min，8%A→8%A；22～23 min，8%A→10%A； 23～35 min，10%A→10%A）。检测波长：240 nm；流速：1.0 mL.min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。理论板数按獐牙菜苷计应大于3000，HPLC图如图5所示。A.对照品;B.样品;C.空白溶剂;1.马钱苷酸;2.绿原酸;3.獐牙菜苷

2.5.4线性关系及定量限、检测线考察 将“2.5.1”项下混合对照品储备液按不同的倍数稀释。稀释液分别按色谱条件进样10 μL，测定并计算平均峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），以色谱峰面积为纵坐标（Y）进行线性关系考察。结果，各待测成分线性关系均良好（r>0.9995）。配制一个较低浓度的对照品溶液，注入液相色谱仪进行测定，记录峰面积，分别以信噪比3∶1、10∶1测定检测限、定量限。结果见表3。

2.5.5精密度试验 取同一对照品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件于同一天内连续进样6次，记录峰面积。结果显示，马钱苷酸，绿原酸，獐牙菜苷峰面积的RSD分别为0.95%、0.86%、0.72%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.5.6重复性试验 取同一批次五转七药材粉末共6份，每份0.5 g，精密称定，按“2.5.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，代入标准曲线计算样品中各成分含量。结果显示，马钱苷酸，绿原酸，獐牙菜苷含量的RSD分别为0.74%、0.49%、0.83%（n=6），表明方法重复性良好。

2.5.7稳定性试验 取五转七药材粉末（过四号筛）0.5 g，精密称定，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0 h、6 h、12 h、18 h、20 h、24 h时，按“2.5.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，马钱苷酸、绿原酸、獐牙菜苷峰面积的RSD分别为0.74%、0.87%、0.68%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.8加样回收率试验 取已知含量的同一批五转七样品6份，每份0.25 g，精密称定，分别加入药材中獐牙菜苷含量的约50%的对照品溶液，按“2.5.2”項下方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果显示，马钱苷酸、绿原酸、獐牙菜苷的平均加样回收率分别为106.32%、96.70%、98.54%，RSD分别为1.21%、0.58%、1.62%（n=6），表明本方法准确度良好。结果见表4。

2.5.9样品含量测定 分别取10批五转七药材粉末适量，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.5.3”项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并根据标准曲线计算各成分的含量。结果10批五转七样品中，马钱苷酸、绿原酸、獐牙菜苷的含量分别为0.0172%～0.0611%、0.0043%～0.0405%、0.0956%～0.2234%。结果见表5。

3讨论

3.1TLC鉴别与含量测定指标成分的选择 文献［11］报道，穿心莛子藨主要化学成分为环烯醚萜类、黄酮类等，熊果酸具有清热、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗溃疡、降低血糖、抗氧化等多种生物学效应［11］，獐牙菜苷为环烯醚萜类成分，其具有保护骨关节、镇痛、抗炎、保肝等药理活性作用［12］；马钱苷酸具有抗炎等药理作用［13］；绿原酸具有抗菌、抗炎、抗诱变等药理作用［14］，与五转七“利尿消肿，理气活血”的主要功效相关。研究前也尝试过鉴别及测定其他成分，但结果不理想，最终确定选用熊果酸作为五转七药材TLC鉴别的指标成分，选择獐牙菜苷作为该药材含量测定的指标成分。

3.2TLC条件筛 选本研究前期对不同的湿度（32 ％RH和88 ％RH）以及温度（4 ℃和35 ℃）的耐用性进行了考察，结果表明，不同温度下Rf值会随温度的升高而有所增大，湿度对薄层色谱斑点无明显影响。此外还对不同展开系统［二氯甲烷—甲醇—冰醋酸（10∶1.6∶0.1）、环己烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶6∶1）、环己烷—二氯甲烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）］、不同显色条件和观察方法［5%香草醛硫酸、10%硫酸乙醇（日光、紫外光灯（365 nm）、3%三氯化铝（日光、紫外光灯（365 nm）］进行了考察，结果显示，以环己烷—二氯甲烷—乙酸乙酯—冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）为展开剂，以10%硫酸乙醇为显色剂，在紫外光灯（365 nm）条件下，供试品与对照品色谱在相应位置上显示相同颜色的斑点，且斑点清晰，Rf值适中，无拖尾，故以此为展开条件。

3.3HPLC供试品溶液制备方法考察 本研究前期对不同的提取溶媒（95%、70%、50%、30%乙醇，70%、50%、30%甲醇）、不同提取方式（超声、回流）、不同溶媒用量（25 mL、50 mL、100 mL）、不同提取时间（15 min、30 min、60 min）等因素进行了考察，结果表明，以甲醇为提取溶媒时，獐牙菜苷、马钱苷酸、绿原酸干扰峰少且峰形较好，故选择甲醇作为提取溶媒；两种提取方法均能较好地提取出有效成分，考虑到操作简便易行，选择超声作为提取方法；溶媒用量为25 mL，提取30 min时，獐牙菜苷、马钱苷酸、绿原酸提取效率较高。

3.4HPLC色谱条件的选择 本研究通过对马钱苷酸、绿原酸、獐牙菜苷3种成分在190～400 nm波长范围内进行全波长扫描，得到3种成分的最大吸收波长依次为236 nm、327 nm、246 nm，经过各波长色谱峰比较，在240 nm波长时色谱图峰形最好，分离度均大于1.5且基线平稳，由此选择240 nm为检测波长。此外，本研究也对不同流动相（甲醇-0.2%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液）、不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃）、不同流速（0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.2 mL·min-1、不同色谱柱（Chromsil C18、 HypersilgoldC18、 Zorbax Eclipse XDB-C18）等进行了考察，结果表明，以甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相时獐牙菜苷、马钱苷酸、绿原酸有较好的分离度，该方法系统耐用性良好。

3.5含量测定结果分析 根据实验结果，五转七药材中獐牙菜苷含量最高（獐牙菜苷、马钱苷酸、绿原酸的平均含量分别为13.51 mg·g-1、4.00 mg·g-1、1.87 mg·g-1），占测定的3种成分总含量的64.60%。综合考虑獐牙菜苷成分的药理活性作用及五转七药材的功效，选择獐牙菜苷作为该药材的含量限定指标成分。

4结论

根据2020年版《中国药典》［9］（四部）通则中关于中药材质量控制的要求，本研究对五转七药材的性状、显微鉴别、薄层鉴别、水分、酸不溶性灰分和浸出物、含量测定进行系统研究，为羌药五转七药材质量标准的制订提供了科学依据。

综上所述，根据研究结果，初步拟定了羌药五转七中水分、总灰分、酸不溶性灰分分别不得过10.0%、7.0%、3.0%，醇溶性浸出物不得低于8.0%，獐牙菜苷的含量不得低于0.10%。所建方法准确可靠、重复性好，为五转七药材质量标准的制定奠定了基础。本研究不足之处在于样品批次较少，后续将继续采集其他不同产地的样品进行研究，以建立更加完善的药材质量标准。

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（收稿日期：2022-09-02编辑：陶希睿）