HPLC法测定贞芪扶正颗粒中4个成分的含量

贾安 茹国华 黄小强 黄涛 王彩霞 张世宇 张廷茹

【摘要】目的：建立同时测定贞芪扶正颗粒中4种成分含量的高效液相色谱法。方法：采用HPLC法，色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6mm×150 mm，4 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱，检测波长为216 nm，体积流量为1 mL·min-1，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。结果：红景天苷、酪醇、芦丁和特女贞苷质量浓度分别在0.524～52.4 μg·L-1、0.908～90.8 μg·L-1、1.656～165.6 μg·L-1和8.376～837.6 μg·L-1范围内与峰面积呈良好的线性关系，其相关系数分别为0.9997、0.9997、0.9996和0.9993，平均加样回收率分别为96.58%、101.21%、99.47%和102.53%；RSD分别为3.56%、1.29%、2.67%和3.68%。结论：该分析方法适用于贞芪扶正颗粒中特女贞苷、红景天苷、芦丁和酪醇的含量测定。

【关键词】贞芪扶正颗粒；HPLC；含量测定

【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）10-0034-05

Determination of Four Components in Zhen Qi Fu Zheng Granules by HPLCJIA An1RU Guohua1，2HUANG Xiaoqiang1HUANG Tao1*WANG Caixia1ZHANG Shiyu1ZHANG Tingru1

1.Medical School， Huanghe Science & Technology College， Zhengzhou 450063， China；

2.College of Pharmacy， Henan Uinversity， Kaifeng 475004， ChinaAbstract：Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of four components in Zhen Qi Fu Zheng granules.Methods The chromatographic column was Agilent poroshell 120 ec-C18 （4.6 mm×150 mm，4 μ m） ， the mobile phase acetonitrile water， gradient elution; The detection wavelength is 216 nm; The volume flow rate is 1 mL·min-1， The column temperature is 30 ℃， and the injection volume is 10 μ L. Results  The mass concentrations of Salidroside， Tyrosol， Rutin and Ligustrum lucidum glycoside showed a good linear relationship with the peak area in the range of 0.524-52.4 μg·L-1， 0.908-90.8 μg·L-1， 1.656-165.6 μg·L-1 and 8.376-837.6 μg·L-1， respectively.The correlation coefficients were 0.9997， 0.9997， 0.9996 and 0.9993， and the average recoveries were 96.58%， 101.21%， 99.47% and 102.53% respectively; RSD was 3.56%， 1.29%， 2.67% and 3.68% respectively.Conclusion The analytical method established in this experiment is applicable to the determination of Ligustrum lucidum glycoside， salidroside， rutin and tyrosol in Zhen Qi Fu Zheng granules.

Keywords：Zhen Qi Fu Zheng Granules; HPLC ; Content Determination

貞芪扶正颗粒由黄芪和女贞子两味常见中药组成，具有提高人体免疫功能、保护骨髓和肾上腺皮质的功效［1］。贞芪扶正颗粒可用于各种疾病引起的机体损伤，有利于促进机体正常功能的恢复［2-4］。黄芪具有健脾补中、升阳举陷、益卫固表、利尿、托毒生肌的功效，其主要成分为黄芪总苷，黄芪总苷具有增强机体免疫力，促进生长，提高机体抗氧化能力的作用［5］。女贞子具有滋补肝肾、明目乌发的功效［6］，女贞子的化学成分主要有红景天苷、特女贞苷、酪醇［7-8］。红景天苷有抗炎、抗氧化、抗癌等作用［7］。特女贞苷有保肝、抗肿瘤、增强免疫力等作用［8］。酪醇又称羟基苯乙醇，有抗氧化应激、神经保护、抗炎等作用［9］。芦丁又名芸香苷，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用［10］。目前关于贞芪扶正颗粒质量控制的研究多集中在单一或两个成分的测定及其指纹图谱的研究，尚未见到同时对贞芪扶正颗粒4种化学成分含量测定的报道。为了能够更加全面地对贞芪扶正颗粒进行质量评价，本研究采用HPLC法对5个不同厂家的8批次贞芪扶正颗粒中的红景天苷、特女贞苷、芦丁和酪醇进行含量测定，以期为贞芪扶正颗粒的质量控制提供参考。红景天苷、酪醇、芦丁和红景天苷的结构式如图1所示。

1仪器与材料

1.1仪器 Agilent 1260液相色谱仪，美国安捷伦公司；FA2004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；十万分之一电子天平，梅特勒-托利仪器上海有限公司；EPED-Z1-10T超纯水机，南京易普易达科技发展有限公司；KQ-300W型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2材料 贞芪扶正颗粒（无糖型）6个厂家，8样品批次，见表1；特女贞苷（批号：39011-92-2，HPLC≥98%）、红景天苷（批号：10338-51-9，HPLC≥98%）、芦丁（批号：153-18-4，HPLC≥98%）和酪醇（批号：501-94-0，HPLC≥98%）標准品均购自上海源叶生物科技有限公司；色谱乙腈和色谱甲醇均购自德国默克公司；其他试剂均为分析级。

2方法与结果

2.1色谱条件 ［11-12］色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流动相：乙腈（A）-水溶液（B），梯度洗脱；检测波长：216 nm；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃。洗脱条件见表2。

2.2溶液制备

2.2.1混合标准品溶液 分别精密称取适量特女贞苷、红景天苷、芦丁和酪醇4种对照品，置于10 mL容量中，加入甲醇制成每1 mL含有红景天苷52.4 μg、特女贞苷837.6 μg、芦丁165.6 μg和酪醇90.8 μg的标准品溶液。

2.2.2供试品溶液 ［13］分别取适量贞芪扶正颗粒样品置于研磨中，充分研磨成细粉，并分别精密称取细粉2 g，置于50 mL锥形瓶中，加入甲醇20 mL。称定重量，超声30 min，放冷，再次称定，加甲醇补足重量，摇匀，过0.45 μm滤头，备用。

2.3方法学考察

2.3.1系统适用性试验 取供试品溶液、混合标准品溶液，按照“2.1”色谱条件进样分析，记录色谱图，结果如图2所示。由图2可知，在该色谱条件下红景天苷、酪醇、芦丁和特女贞苷的色谱峰与相邻峰达到基线分离，分离度均大于1.5，分离效果良好。1.红景天苷；2.酪醇；3.芦丁；4.特女贞苷

2.3.2线性关系考察 分别精密量取混合标准品母液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.60 mL和2.00 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成不同浓度的混合对照品溶液。按照“2.1”色谱条件依次进样，以标准品质量浓度（μg·L-1）为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程。结果见表3。

2.3.3仪器精密度试验 取“2.2.1”混合标准品溶液，在“2.1”条色谱条件下重复进样6次，记录色谱峰面积，测得红景天苷、酪醇、芦丁和特女贞苷色谱峰峰面积的RSD分别为2.7%、2.8%、1.3%和0.5%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

2.3.4重复性试验 取同一批贞芪扶正颗粒（批号：20201104），按“2.2.2”方法制备供试品溶液，平行制备6份，在“2.1”条色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积，计算结果显示，红景天苷的平均含量为0.3173 mg·g-1，RSD为2.1%；酪醇的平均含量为0.0996 mg·g-1，RSD为0.3%；芦丁的平均含量为0.3084 mg·g-1，RSD为0.7%；特女贞苷的平均含量为4.2947 mg·g-1，RSD为0.5%，结果表明方法重复性良好。

2.3.5稳定性试验 取同一批贞芪扶正颗粒（批号：20201104），室温放置，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12和24 h，按“2.1”条色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，计算样品中红景天苷、酪醇、芦丁和特女贞苷的RSD分别为2.2%、0.7%、0.6%和0.8%。结果表明样品室温放置24 h内稳定。

2.3.6加样回收率试验 取已知含量的贞芪扶正颗粒（批号：20201104）6份，每份约1.0 g，精密称定。分别精密加入等量的对照品，按“2.2.2”方法制备供试品溶液，在“2.1”条色谱条件下进样分析，计算得出4个成分的平均回收率分别为99.82%、99.90%、100.09%和100.41%；RSD分别为1.81%、2.51%、2.44%和1.80%。结果见表4。

2.4样品含量测定 精密称定贞芪扶正颗粒粉末2 g，按“2.2.2”方法制备供试品溶液，在“2.1”条色谱条件下进行测定。采用外标法以峰面积计算红景天苷、酪醇、芦丁和特女贞苷的含量。结果见表5。

3讨论

3.1提取条件的考察 首先对无水乙醇、水、甲醇三种提取溶剂进行考察，发现使用甲醇作提取溶剂时，提取出的供试液中四种成分的综合含量最高；然后考察加热回流和超声波法提取两种提取方式，提取时间为30 min，发现超声波提取法提取出的供试液中四种成分含量高于加热回流提取，接着采用不同时间超声（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）处理时，发现超声波处理30 min的供试液中四种成分含量高于10 min和20 min，但是超声处理30 min、40 min和50 min的供试液中四种成分提取含量无明显差异性。综合以上情况本研究选择超声处理 30 min提取。

3.2检测波长的考察 本实验分别考察了检测波长为216 nm、240 nm和250 nm时各标准品的响应，当检测波长为216 nm时，各峰的分离度较好，基线较平，而且峰面积也较大，所以本研究选择在216 nm处对四种成分进行含量检测。

3.3流动相的考察 本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水两种流动相进行梯度洗脱时的色谱分离情况，当选择甲醇-水作为流动相时红景天苷分离效果不佳，且杂峰较多；当采用乙腈-水作为流动相时，四种化学成分均能够达到良好分离，满足分析要求。因此，本实验选择乙腈-水作为流动相。

3.4不同厂家四种成分含量比较 根据实验结果表明，红景天苷含量最高的为厂家S1，S6次之，S5含量最低只有0.0036 mg·g-1，相差将近90倍；酪醇含量S6最高，S1次之，S5含量最低只有0.0099 mg·g-1，相差近27倍；芦丁含量最高S3，S2次之，S5含量最低只有0.0127 mg·g-1，相差將近32倍；特女贞苷含量最高S1，S4次之，S5含量最低只有0.1832 mg·g-1，相差将近24倍。另外，也可以发现对于同一厂家（S2和S5）生产的贞芪扶正颗粒不同批次之间也是有一定差异。但从研究结果来看，S1、S6、S4厂家生产的贞芪扶正颗粒质量较好，S5厂家产品最差。关于不同厂家生产的贞芪扶正颗粒药效的评价，还需要进一步通过药理实验进行评价。

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（收稿日期：2022-09-08编辑：陶希睿）