人胰岛素及其类似物中残留溶剂测定方法研究

孙悦，胡馨月，丁晓丽，李晶，吕萍，张慧，梁成罡

·论著·

人胰岛素及其类似物中残留溶剂测定方法研究

孙悦，胡馨月，丁晓丽，李晶，吕萍，张慧，梁成罡

102629 北京，中国食品药品检定研究院激素室/国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室

建立人胰岛素及其类似物中有机溶剂残留测定方法，用同一方法测定目前在人胰岛素及类似物生产工艺中普遍存在的甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇 5 种残留溶剂。采用顶空气相色谱法，使用 DB-624 毛细管柱（30 m × 0.53 mm，3 μm），载气为氮气，流速为 2.5 ml/min，检测器为氢火焰离子化检测器，检测器温度为 250 ℃，进样口温度为 200 ℃，分流比为 5:1，顶空平衡温度为 85 ℃，平衡时间为 20 min，柱温程序为：起始温度 40 ℃，保持10 min，随后以 5 ℃/min升至 80 ℃，随后以 20 ℃/min 升至 200 ℃。甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈及正丙醇峰之间分离良好；专属性、耐用性、精密度良好；甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇分别在 1.5 ～ 60.8、1.1 ～ 98.9、0.8 ～ 100.4、0.7 ～ 10.4、0.8 ～ 100.1 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系（2均大于 0.99）；甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇检出限分别为 0.6、0.3、0.2、0.2、0.2 μg/ml，定量限分别为 1.5、1.1、0.8、0.7、0.8 μg/ml；各溶剂在人胰岛素及其类似物中平均加标回收率（n = 9）均在 90% ～ 110% 范围内，准确度良好。该方法可操作性强、准确、灵敏度高，适用于人胰岛素及其类似物中甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇 5 种残留溶剂测定。

人胰岛素及其类似物； 顶空气相色谱法； 残留溶剂； 方法学验证

人胰岛素及其类似物由重组 DNA 技术制备得到，是 1 型糖尿病患者的基本治疗方法，也是许多长期 2 型糖尿病患者常见的治疗选择[1]。人胰岛素由 A、B 两条以分子间二硫键连接起来的肽链组成，A 链 21 个氨基酸，B 链 30 个氨基酸，胰岛素类似物在人胰岛素结构基础上进行氨基酸替换和脂肪酸链化学修饰，以改变吸收速率、作用持续时间、提高作用的再现性，并调节各种靶组织中的相对功效[1-3]。

药品中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中，以及在制剂制备过程中使用的，但在工艺过程中未能完全去除的有机溶剂[4]。人胰岛素及类似物下游生产工艺步骤包括包涵体清洗、包涵体溶解、胰岛素原融合蛋白提取、缓冲液交换、胰岛素原纯化、胰岛素原复性、酶切、胰岛素纯化、结晶和冻干等步骤[5]。以上工艺中常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇、乙酸等，其中乙腈、甲醇属于第二类溶剂，应该限制使用，乙醇、异丙醇和正丙醇属于第三类溶剂，应根据生产工艺的特点，制订相应的限度，使其符合产品规范、药品生产质量管理规范（GMP）或其他基本的质量要求[4]。

2020 年版《中华人民共和国药典》三部、《美国药典》43 版、《欧洲药典》10.0 版均收载了人胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素及德谷胰岛素，现行标准为国家药品标准和进口药品注册标准。目前，获得人胰岛素及其类似物批准文号的企业及在注册的企业较多，残留溶剂测定方法各异。针对这一问题，本文对人胰岛素及其类似物中残留溶剂测定进行了研究，建立了一种气相色谱方法同时测定 5 种残留溶剂，包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇，并进行了方法学验证。该法可操作性强、专属性好、准确、灵敏度高，能够保证产品质量可控，节省检测成本，为标准提高提供数据支持和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

7890A型气相色谱仪和 7890B 型顶空进样器为美国 Aglient 公司产品；ME155DU 电子天平为瑞士梅特勒-托利多公司产品；人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素为中检院激素室留样；甲醇、无水乙醇、异丙醇为国药集团化药试剂有限公司产品（含量≥ 99.5%）；正丙醇、乙腈和二甲基亚砜为美国 Sigma Aldrich 公司产品（含量≥ 99.5%）；盐酸、磷酸购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 顶空条件 采用 DB-624 毛细管柱（30 m × 0.53 mm，3 μm），载气为氮气，流速为 2.5 ml/min，检测器为 FID，检测器温度为 250 ℃，进样口温度为 200 ℃，分流比为5:1，顶空平衡温度为 85 ℃，平衡时间为 20 min，柱温程序为：起始温度 40 ℃，保持 10 min，随后以 5 ℃/min升至 80 ℃，随后以 20 ℃/min升至 200 ℃。

1.2.2 供试品与对照品溶液配制

⑴供试品溶液：取人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素，分别精密称取 50 mg 置 20 ml 顶空瓶中，加 0.01 mol/L 盐酸溶液 5 ml溶解，摇匀，压盖密封，作为供试品溶液。

⑵对照品储备液：分别精密称取甲醇 150 mg、乙醇 250 mg、异丙醇 250 mg、乙腈20.5 mg、正丙醇 250 mg 置 50 ml 量瓶中，用 0.01 mol/L 盐酸溶液稀释并定容至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

⑶混合对照品溶液：分别精密量取各对照品储备液 1.0 ml 置同一 100 ml 量瓶中，用 0.01 mol/L 盐酸溶液稀释并定容至刻度，摇匀，量取 5 ml 置 20 ml 顶空瓶中，压盖密封，作为混合对照品溶液。

1.2.3 专属性样品制备 分别量取混合对照品溶液、0.01 mol/L 盐酸溶液 5 ml 置 20 ml 顶空瓶中，压盖密封，作为专属性溶液。

1.2.4 线性样品制备 分别精密量取各对照品储备液适量置同一量瓶，用 0.01 mol/L 盐酸溶液梯度稀释得到 LOQ、L1 ～ L7 系列混合线性溶液，其中甲醇浓度分别为 1.5、5.2、10.0、20.4、30.4、40.4、50.8、60.8 μg/ml，乙醇浓度分别为 1.1、8.4、16.3、33.1、49.4、65.8、82.6、98.9 μg/ml，异丙醇浓度分别为 0.8、8.5、16.6、33.6、50.2、66.8、88.9、100.4 μg/ml，乙腈浓度分别为 0.7、0.9、1.7、3.5、5.2、6.9、8.7、10.4 μg/ml，正丙醇浓度分别为 0.8、8.5、16.5、33.5、50.0、66.5、83.6、100.1 μg/ml，分别量取各混合线性溶液 5 ml 置 20 ml 顶空瓶中，压盖密封即得。

1.2.5 精密度样品制备 取混合对照品溶液，连续进样 6 针考察精密度。

1.2.6 检测限与定量限样品制备 分别量取甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇对照品储备液适量，用 0.01 mol/L 盐酸溶液依次稀释，量取 5 ml 置 20 ml 顶空瓶中，压盖密封，以信噪比 S/N = 3 时相应的浓度确定检测限，以信噪比 S/N = 10 时相应的浓度确定定量限。

1.2.7 准确度样品制备 取人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素，分别精密称取 50 mg 置 20 ml 顶空瓶中，平行 9 份，分为 3 组，分别用 5 ml 线性溶液 L3、L4、L5 溶解，得到 70%、100%、130% 浓度水平准确度考察溶液。

1.2.8 溶液稳定性样品制备 取人胰岛素及其类似物 100% 浓度水平准确度考察溶液，于 0、2、24 h 进行检测，考察溶液稳定性。

1.2.9 耐用性样品制备 分别改变分流比（10:1）、流速（3.0 ml/min）、顶空加热时间（15 min）、顶空加热温度（80 ℃）、气相色谱柱[DB-624 毛细管柱（30 m × 0.31 mm，1.8 μm）]，取混合对照品溶液进样测定，考察方法耐用性。

2 结果

2.1 专属性

如图 1 所示，空白溶液对甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇检测无影响，专属性良好。5 种溶剂峰间分离度分别为 12.4、8.8、2.0、18.2，理论塔板数分别为 26416、30029、25005、35164、42914，分离度良好，柱效高。

2.2 线性

分别以甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，线性范围、线性回归方程见表 1，2均大于 0.99，线性良好。

2.3 精密度

取精密度考察溶液，连续进样 6 针，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇峰面积 RSD% 分别为 0.7%、0.5%、1.1%、0.5%、0.9%，精密度良好。

图1 空白溶液色谱图（A）和混合对照品溶液色谱图（B）

Figure 1 Chromatogram of blank solution (A) and mixed reference solution (B)

表1 5 种残留溶剂线性关系结果

Table 1 Linear relationship results of 5 residual solvents

名称 Name线性范围（μg/ml） Linear range (μg/ml)线性回归方程 Linear regression equation相关系数r2 Coefficient r2 甲醇 Methanol1.5 ～ 60.8y = 2.1286x + 0.24580.9998 乙醇 Ethanol1.1 ～ 98.9y = 4.384x – 0.10650.9997 异丙醇 Isopropanol0.8 ～ 100.4y = 8.9556x + 1.06850.9997 乙腈 Acetonitrile0.7 ～ 10.4y = 7.5009x + 0.40930.9985 正丙醇 N-propanol0.8 ～ 100.1y = 8.4692x – 1.07440.9997

2.4 检测限与定量限

以信噪比 S/N = 3 时相应的浓度确定检测限，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇检测限分别为 0.6、0.3、0.2、0.2、0.2 μg/ml；以信噪比 S/N = 10 时相应的浓度确定定量限，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇检测限分别为 1.5、1.1、0.8、0.7、0.8 μg/ml。

2.5 准确度

准确度考察结果见表 2，人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素样品平均加标回收率均在 90% ～ 110% 范围内，准确度良好。

2.6 溶液稳定性

分别于 0、2、24 h 测定人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素 100% 浓度水平准确度考察溶液中各溶剂含量，测定结果见表 3，甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇含量 RSD%（n = 3）均小于5.0%，溶液稳定性良好。

2.7 耐用性

在不同耐用性条件下分别采用外标法测定混合对照品溶液中甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、正丙醇含量，测定结果如表 4 所示，含量 RSD% 均小于 5.0%，方法耐用性良好。

表2 人胰岛素及其类似物加标回收率结果

Table 2 Results of spiked recovery of human insulin and its analogues

名称Name残留溶剂Residualsolvent浓度水平70%Concentration level 70%浓度水平100%Concentration level 100%浓度水平130%Concentration level 130%平均回收率（%）Averagerecoveries(%)RSD%（n = 9） 理论值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)实测值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理论值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)实测值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理论值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)实测值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%) 人胰岛素Humaninsulin甲醇Methanol20.421.5105.430.431.8104.640.441.3102.0103.12.0 20.7101.531.2102.642.5105.1 21.4104.930.299.341.5102.5 乙醇Ethanol33.132.999.349.449.6100.465.865.799.998.61.2 32.497.848.698.364.998.7 32.497.847.796.664.898.5 异丙醇Isopropanol33.632.997.750.248.496.566.865.698.296.31.4 32.897.548.095.662.793.9 32.396.047.795.064.296.1 乙腈Acetonitrile3.53.6103.75.25.3101.96.96.898.8100.72.4 3.5100.25.198.16.797.5 3.6104.65.3102.06.999.7 正丙醇N-propanol33.532.496.650.048.496.766.565.298.096.21.2 32.697.247.995.762.894.4 32.195.947.394.664.396.6 门冬胰岛素Insulinaspart甲醇Methanol20.421.1103.430.430.5100.440.441.3102.2102.11.9 21.1103.729.898.042.1104.1 20.9102.430.9101.541.6102.8 乙醇Ethanol33.132.899.149.449.199.365.865.599.699.11.0 33.199.847.997.064.798.4 33.2100.349.299.465.399.3 异丙醇Isopropanol33.632.095.250.248.596.666.862.994.295.01.0 31.794.247.494.463.194.5 31.794.348.596.663.895.5 乙腈Acetonitrile3.53.497.75.25.2100.26.96.695.198.02.0 3.396.15.3101.06.796.9 3.498.25.197.56.999.3 正丙醇N-propanol33.531.995.050.048.196.066.562.594.094.90.8 31.694.347.194.262.894.4 31.694.348.095.963.595.5 赖脯胰岛素Insulinlispro甲醇Methanol20.420.098.130.431.4103.240.440.299.4100.72.2 20.399.731.2102.640.299.4 20.7101.429.998.342.0103.9 乙醇Ethanol33.132.096.749.450.0101.165.864.397.999.71.8 33.5101.248.497.965.9100.2 32.196.949.5100.166.0100.4 异丙醇Isopropanol33.631.794.250.248.797.066.863.895.695.01.1 31.794.147.594.763.294.6 31.994.947.293.964.196.0 乙腈Acetonitrile3.53.497.65.25.197.16.96.695.698.22.2 3.6102.55.095.96.797.5 3.599.05.299.26.999.7 正丙醇N-propanol33.531.594.150.048.596.966.563.194.895.01.2 32.195.747.795.362.593.9 31.995.146.693.164.096.2

续表 2

名称Name残留溶剂Residualsolvent浓度水平70%Concentration level 70%浓度水平100%Concentration level 100%浓度水平130%Concentration level 130%平均回收率（%）Averagerecoveries(%)RSD%（n = 9） 理论值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)实测值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理论值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)实测值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%)理论值（μg/ml）Theoreticalvalue(μg/ml)实测值（μg/ml）Measuredvalue(μg/ml)回收率（%）Recoveryrate(%) 甘精胰岛素Insulinglargine甲醇Methanol20.420.9102.630.429.797.740.443.4107.3101.02.9 20.399.631.0101.840.499.9 20.7101.729.697.441.0101.3 乙醇Ethanol33.135.4107.049.448.497.965.869.0105.0102.72.9 34.0102.551.7104.566.2100.7 34.6104.448.999.067.8103.1 异丙醇Isopropanol33.632.396.050.246.893.266.866.098.895.62.5 31.192.447.795.065.698.3 31.994.946.893.365.698.2 乙腈Acetonitrile3.53.5101.05.25.095.96.96.9100.298.12.2 3.496.55.197.16.999.3 3.497.74.994.96.999.9 正丙醇N-propanol33.532.095.350.046.492.866.565.999.195.12.7 30.691.347.795.464.997.5 31.594.046.492.764.997.6 地特胰岛素Insulindetemir甲醇Methanol20.421.1103.730.430.9101.640.442.0103.8103.51.3 21.2104.231.7104.141.0101.3 21.6105.831.3102.842.0103.8 乙醇Ethanol33.133.3100.549.449.199.265.867.7103.0100.41.5 33.2100.149.6100.365.098.9 34.0102.749.199.365.599.7 异丙醇Isopropanol33.632.295.850.247.494.466.865.698.296.01.3 32.195.548.195.864.396.3 32.997.847.794.963.995.7 乙腈Acetonitrile3.53.6102.55.25.299.86.96.897.8101.01.7 3.5101.55.3102.07.0101.2 3.6103.55.3100.96.999.5 正丙醇N-propanol33.532.095.450.047.294.366.565.798.796.31.7 32.797.448.096.063.795.8 33.198.847.394.563.695.5 德谷胰岛素Insulindegludec甲醇Methanol20.420.4100.230.430.4100.040.440.299.499.91.9 19.696.230.399.840.098.9 20.098.331.4103.139.597.7 乙醇Ethanol33.132.197.049.447.796.465.863.897.198.12.1 31.494.749.099.164.698.3 33.6101.549.199.365.399.3 异丙醇Isopropanol33.631.493.250.246.592.666.862.393.294.02.3 31.593.745.590.564.796.9 31.693.847.594.565.397.7 乙腈Acetonitrile3.53.496.25.25.198.96.96.898.098.51.2 3.599.25.2100.56.898.6 3.497.65.299.36.898.1 正丙醇N-propanol33.531.794.550.047.394.666.562.193.394.61.4 31.894.746.292.364.296.5 31.794.447.695.164.096.2

表3 溶液稳定性结果

Table 3 Solution stability results

名称Name含量RSD%（n = 3） Content RSD% (n = 3) 甲醇 Methanol乙醇 Ethanol异丙醇 Isopropanol乙腈 Acetonitrile正丙醇 N-propanol 人胰岛素 Human insulin3.32.71.53.43.2 门冬胰岛素 Insulin aspart2.00.71.31.71.0 赖脯胰岛素 Insulin lispro2.70.91.63.02.0 甘精胰岛素 Insulin glargine1.22.52.72.72.4 地特胰岛素 Insulin detemir2.52.93.60.73.8 德谷胰岛素 Insulin degludec1.81.61.23.82.7

表4 耐用性结果

Table 4 Durability results

耐用性改变条件Durability change conditions实测值（μg/ml） Measured value (μg/ml) 甲醇Methanol乙醇Ethanol异丙醇Isopropanol乙腈Acetonitrile正丙醇N-propanol 原方法 Original method20.433.133.63.533.5 分流比10:1 Split ratio 10:121.934.733.43.534.2 流速3.0 ml/min Velocity of flow 3.0 ml/min20.633.634.43.834.3 顶空加热时间15 min Headspace heating time 15 min20.633.033.53.532.7 顶空加热温度80 ℃ Headspace heating temperature 80 ℃20.534.034.83.634.9 气相色谱柱[DB-624 毛细管柱（30 m × 0.31 mm，1.8 μm）]Gas chromatography column [DB-624 capillary column (30 m × 0.31 mm, 1.8 μm)]20.632.933.63.433.6 RSD（%）2.72.01.73.72.2

3 讨论

气相色谱法是测定残留溶剂的常用方法，气相色谱程序主要有三种方法：直接进样法、顶空分析法和固相微萃取法[6]。本文根据人胰岛素及其类似物和各待测溶剂理化性质，选择顶空-气相色谱法进行分析研究，顶空法具有样品前处理简单、溶剂峰小、更洁净等优势。本研究考察了人胰岛素及其类似物在0.01 mol/L 盐酸溶液、1% 磷酸溶液、二甲基亚砜中的溶解性，结果显示在0.01 mol/L 盐酸溶液中溶解性好，气液分配系数小，灵敏度高。采用混合对照品溶液考察顶空加热时间、顶空加热温度，结果显示温度越高，溶剂峰面积越大，相同温度加热 15 ～ 35 min，溶剂峰面积基本一致，说明加热 15 min 时即达到气液平衡。本研究还考察了不同气相色谱柱、柱温程序等条件，最终建立了专属性好、准确、灵敏度高的顶空-气相色谱法。

有机溶剂残留关乎制品质量的安全性及可控性。近年来，人胰岛素及其类似物成为研发热点，鉴于生产工艺中使用的有机溶剂种类比较相近或相同，且制品理化性质相近，建立通用型测定方法能够同时应用于 6 个胰岛素品种的 5 种有机溶剂残留测定，应用范围广，能够解决各企业测定方法各异、部分方法繁琐等问题。2020 年版《中华人民共和国药典》三部凡例规定，生产过程中如采用有机溶剂或其他物质进行提取、纯化或灭活处理等，生产的后续工艺应能有效去除。有机溶剂残留量应符合残留溶剂测定法的相关规定（通则 0861）[7]。甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇限度分别为 0.3%、0.5%、0.5%、0.041%、0.5%，本文考察了各有机溶剂定量限至 200% 浓度水平线性范围及70%、100%、130% 浓度水平加标回收率，线性及准确度良好，能够用于人胰岛素及其类似物中甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和正丙醇残留溶剂分析，对标准提高以及残留溶剂分析方法的进一步标准化提供了参考。

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国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 2020年版三部. 北京: 中国医药科技出版社, 2020:XIV-XV.

Determination of residual solvents in human insulin and its analogues

SUN Yue, HU Xin-yue, DING Xiao-li, LI Jing, LYU Ping, ZHANG Hui, LIANG Cheng-gang

Author Affiliation: Division of Hormone, National Institutes for Food and Drug Control, NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drugs, Beijing 102629, China

To establish a method for the determination of organic solvent residues in human insulin and its analogues, and to determine the residual solvents of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol simultaneously.Headspace gas chromatography using DB-624 capillary column (30 m × 0.53 mm, 3 μm) with conditions as follows: ① the carrier gas is nitrogen; ② the flow rate is 2.5 ml/min; ③ the detector is a flame ionization detector; ④ the detector temperature is 250 ℃; ⑤ the injection port temperature is 200 ℃; ⑥ the split ratio is 5:1; ⑦ the headspace equilibrium temperature is 85 ℃; ⑧ the equilibrium time is 20 min. The column temperature program is as follows: ① the initial temperature is 40 ℃, and maintained for 10 min; ② it is raised to 80 ℃ at 5 ℃/min, and then it is raised to 200 ℃ at 20 ℃/min.The peaks of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol were well separated with good specificity, durability and precision. Methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol show a good linear relationship in the concentration range of 1.5 - 60.8, 1.1 - 98.9,0.8 - 100.4,0.7 - 10.4, and 0.8 - 100.1 μg/ml,respectively (2> 0.99). The detection limits of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol were 0.6, 0.3, 0.2, 0.2, 0.2 μg/ml, respectively. The limits of quantification were 1.5, 1.1, 0.8, 0.7, 0.8 μg/ml, respectively. The average recoveries (n = 9) of all solvents in human insulin and its analogues were in the range of 90% - 110%, and the accuracy was good.The method is operable, accurate and sensitive, and is suitable for the determination of methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile and N-propanol in human insulin and its analogues.

human insulin and its analogues; headspace gas chromatography; residual solvent; method validation

s: LIANG Cheng-gang, Email: liangchenggang@nifdc.org.cn; ZHANG Hui, Email: zhanghui313@sina.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2023.03.003

梁成罡，Email：liangchenggang@nifdc.org.cn；张慧，Email：zhanghui313@sina.com

2023-02-10