c-Myc调控lnc-CCDC117-1对舌鳞癌进展的影响

石清影,朱友明

目前,人类基因组中只有2%的RNA能编码蛋白质[1],其余98%为非编码RNA[2],其中长度>200 nt的被归类为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)。LncRNAs具有低丰度及组织特异性表达,通过直接与DNA、RNA和(或)蛋白质结合[3]或在染色质、DNA、转录和转录后水平调控基因表达[4],影响神经系统、癌症以及心血管疾病等重大疾病的发生和结局。目前,多种 lncRNAs在肿瘤中具有促癌、抑癌作用,如lncRNA BC200、lncRNA MALAT1、H19等[5]。C-Myc是一种关键的致癌转录因子,参与调控人类基因当中约15%的表达[6-7]。其中包括细胞增殖、分化、凋亡、血管生成、能量代谢、翻译和蛋白合成等一系列生理过程,并与细胞激活和转化相关[8-9]。相关研究[2]表明,c-Myc在肿瘤中有高表达,如Burkitt淋巴瘤、CRC等,并证实c-Myc在恶性肿瘤进展和维持中的关键作用,因此目前其已成为癌症治疗的理想靶点。

因此,鉴于lncRNAs与c-Myc 在肿瘤进展过程中的密切联系,从致癌转录因子c-Myc 切入,利用基因芯片技术在c-Myc tet off的P493细胞中进行筛选(在该系统中,加入Doxycycline后c-Myc会下调),结果显示一些由c-Myc正调控和负调控的新lncRNAs,从中选择了一个表达差异显著且由c-Myc正调控的lncRNA,lnc-CCDC117(ENST00000451486),确定为后续研究对象。Lnc-CCDC117-1定位于人类22号染色体上,长约347个核苷酸。目前,在恶性肿瘤研究的相关进展中鲜有关于lnc-CCDC117-1生物学功能的报道。该研究表明c-Myc与lnc-CCDC117-1两者间调控的相关性;通过构建表达载体及shRNA技术,过表达、敲低lnc-CCDC117-1探究其对舌鳞癌细胞发展的影响,并为舌鳞癌的早期诊断和治疗提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料人胚肾细胞293T、人舌鳞癌细胞系HN6、SCC9、CAL27,人正常口腔上皮细胞HOK、大肠杆菌DH5 α(安徽医科大学口腔实验室保存)。慢病毒载体plko.1-puro、质粒体系pGag、pRev、pVsvg(美国Sigma-Aldrich公司)。表达载体plko.1-shc-Myc、plko.1-sh-ctrl、flag-c-My(+c-Myc)、pGL3质粒、 +c-Myc质粒以及renilla质粒 (中国科学技术大学生命科学院实验室提供)。 表达载体+lnc-CCDC117-1、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、pGL3-lnc-CCDC117-1-wt质粒和pGL3-lnc-CCDC117-1-mut质粒(上海生工生物公司);敲低慢病毒载体plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-1、plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-2以及对照组plko.1-sh-ctrl(本实验室构建); 胎牛血清(上海Lonsera公司)、DMEM 高糖培养基(以色列BI公司);转染试剂lipofectamine2000(美国invitrogen公司,货号:11668019); q-PCR相关试剂(美国Axygen公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 使用含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养液培养HN6、SCC9、CAL27、293T细胞,放置于5%CO2的37 ℃培养箱中常规培养;传代时使用0.25%胰蛋白酶进行消化。

1.2.2plko.1-sh-lnc-CCDC117-1表达载体的构建 从NCBI数据库中查询lnc-CCDC117-1的基因序列,根据plko.1-puro载体的敲低骨架特征,设计plko.1-sh-lnc-CCDC117-1载体构建所需的引物,选择PAGE纯化方式,送上海生工合成。引物序列见表1。分别合成sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2。获得扩增基因后,37 ℃水浴中消化双酶切plko.1-puro载体,回收酶切产物。1%琼脂糖凝胶电泳,由T4连接酶将回收的酶切产物和基因片段连接。将上述连接产物转入感受态大肠杆菌DH5α,涂于LB(含Amp抗性)平板上,37 ℃倒置培养过夜。第2天挑取菌落,筛选阳性克隆,送公司测序鉴定,成功构建plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-1、plko.1-sh-lnc-CCDC117-1-2。

1.2.3慢病毒包装和转染HN6/SCC9/CAL27细胞 取上述已构建成功且携带目的片段的表达载体(3 μg)和病毒包装质粒:3 μg pGag、3 μg pRev、1.5 μg pVsvg,共转染293T细胞,使用不含血清的DMEM培养8 h后更换为10% FBS的正常培养基。40 h后收集病毒上清液,0.45 μm PVDF滤器过滤分装,-80 ℃保存备用。慢病毒转染: 病毒感染前1天,0.25%胰蛋白酶消化HN6/SCC9/CAL27细胞,铺至小皿,待细胞汇合度达60%～70%时,将病毒原液分别感染HN6/SCC9/CAL27细胞。同时加入3.5 μl的polybrene(浓度为8 mg/ml),37 ℃孵育12 h,加入嘌呤霉素筛选1～2周。

1.2.4qRT-PCR检测lnc-CCDC117-1的表达水平 收集转染48 h后的HN6/SCC9/CAL27细胞各5组(转染shc-Myc、+c-Myc、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其各对照组),按TRIzol试剂说明书分别提取各组细胞的总RNA。逆转录合成cDNA模板,-20 ℃保存待用。将含有待扩增序列的cDNA模板进行PCR反应,总体积20 μl包括:上游引物0.8 μl,下游引物0.8 μl,2× q-PCR Mix 10 μl,ROX 0.4 μl,cDNA 2 μl,无菌蒸馏水6 μl。在PCR扩增仪上完成PCR扩增,扩增反应程序为: 95 ℃、2 min,95 ℃、5 s,60 ℃、15 s,72 ℃、20 s,重复55个循环。反应结束后读取各组结果,以β-actin作为分子内参,采用2-ΔΔCt法分析比较各组lnc-CCDC117-1的表达。引物序列见表2。

表2 引物序列

表3 在P493细胞筛选中显示3个lncRNA响应c-Myc

表4 在HN6细胞中验证c-Myc对3个lncRNA的影响

表5 lnc-CCDC117-1基本数据

1.2.5双荧光素酶报告系统检测启动子活性 共转染pGL3-lnc-CCDC117-1-wt与+c-Myc组,pGL3-lnc-CCDC117-1-mut与+c-Myc组及其对照组。转染后48 h加入100 μl细胞裂解液,冰上充分裂解5 min。吸取细胞裂解液至新的EP管中,12 000 r/min离心2 min,收集上清液备用。取干净的EP管放在Promega荧光检测仪中检测本底荧光值,记作L0。吸取10 μl Luciferase Substrate 到新的EP管内,小心的吸取20 μl细胞裂解液上清液,吹打混匀5次后立即放入荧光检测仪中检测。该值是萤火虫荧光素酶的荧光值,记作L1。继续向管中加入10 μl Renilla Substrate工作液,迅速吹打混匀5次放入荧光检测仪中检测。该值为海肾荧光素酶的荧光值,记作R1。整理得到的荧光值,用L1-L0/R1-L0计算出每管样品的数值,绘制柱状图。

1.2.6荧光原位杂交实验检测lnc-CCDC117-1在细胞内的定位 将准备好的细胞置于4%的多聚甲醛,室温下固定15 min。根据试剂盒说明配制好所需溶液(Buffer A,Buffer C,Buffer E,Buffer F)。弃去固定液,每孔加入200 μl 0.1%的Buffer A,室温静置15 min; PBS润洗细胞2次。向孔中加入200 μl 2× Buffer C,37 ℃培养箱中孵育30 min;继续加入200 μl变性处理后的探针混合液,避光孵育至杂交过夜。次日依次向每孔加入200 μl 42 ℃预热的Buffer F、Buffer C浸洗5 min。,避光条件下DAPI染核20 min。滴加3～5 μl抗淬灭剂,于倒置荧光显微镜下观察。

1.2.7生长曲线实验 将转染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其对照组后的HN6/SCC9/CAL27细胞按1×104个/孔密度铺至12孔板,每组设置3个复孔。37 ℃分别培养24、48、72、96 h后收集细胞并计数,绘制生长曲线。

1.2.8CCK-8 法检测HN6/SCC9/CAL27细胞生长 收取转染了sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1及其对照组的HN6/SCC9/CAL27细胞,按照2×103个/孔密度接种于96孔板,设置3个平行复孔。待细胞贴壁,37 ℃分别培养 12、24、48、72 h;加入10 μl CCK-8溶液,继续避光孵育4 h,在酶标仪450 nm处测量各孔的吸光值(OD)。

1.2.9细胞划痕实验 取sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1和对照组HN6、SCC9细胞铺至6孔板,每组设置3个复孔。待细胞贴壁后用20 μl黄枪头划线后培养过夜。24 h后在显微镜下观察拍照,分析对比细胞划痕变化。

1.2.10克隆形成实验 取sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1和对照组CAL27细胞接种于6孔板,400个/孔,设置3个复孔。每孔加入2 ml培养液。培养14 d,4%多聚甲醛室温下固定30 min,1%结晶紫染色4 h,清洗晾干并观察拍照。

2 结果

2.1 lnc-CCDC117-1的筛选与鉴定该研究通过基因芯片技术,在c-Myc tet off的P493细胞中进行筛选(在该系统中,加入Doxycycline后c-Myc会下调),结果显示有一些c-Myc正调控和负调控的lncRNAs。进一步在HN6细胞系中进行验证,从中选择了一个高表达且变化量约15倍的lncRNA:lnc-CCDC117-1(ENST00000451486),认为其表达差异有统计学意义,因此确定为后续研究对象。因在该系统中c-Myc下调,而在此结果中检测到lnc-CCDC117-1表达也下调,故猜测lnc-CCDC117-1受c-Myc正性调控。检测数据见表3-5。qRT-PCR检测HOK、HN6、SCC9、CAL27 4种细胞系中lnc-CCDC117-1的表达情况。显示与HOK对照组相比, HN6组、SCC9组、CAL27组内lnc-CCDC117-1表达水平上调(t=2.804,P<0.05;t=2.866,P<0.05;t=5.374,P<0.01),见图1。因此,选择有高表达水平的HN6、SCC9、CAL27细胞系用于后续实验。

图1 lnc-CCDC117-1在3种口腔癌细胞系中的表达情况

2.2 检测c-Myc对lnc-CCDC117-1启动子活性的影响合成pGL3-lnc-CCDC117-1-wt和pGL3-lnc-CCDC117-1-mut序列,克隆到荧光素酶报告质粒pGL3-basic中。将构建的荧光素酶质粒载体与ctrl、+c-Myc 共转染到293T细胞中,比较各组荧光信号的强弱。结果显示, pGL3-lnc-CCDC117-1-mut和+c-Myc共转染细胞后,细胞的荧光信号值与对照组相比无明显变化,但共转染pGL3-lnc-CCDC117-1-wt和+c-Myc组后荧光信号值显著高于对照组(t=6.133,P<0.01)。见图2。

图2 双荧光素酶报告系统验证c-Myc和lnc-CCDC117-1靶向结合

2.3 lnc-CCDC117-1在细胞中的定位情况

2.3.1核质分离实验 取成功分离的细胞上清液和沉淀,分别通过qRT-PCR和Western blot检测,结果显示lnc-CCDC117-1主要定位于细胞核内(t=22.02,P<0.001)。见图3。

图3 核质分离Western blot法、qRT-PCR法检测lnc-CCDC117-1的定位情况

2.3.2Fish 检测 lnc-CCDC117-1的细胞内定位 倒置荧光显微镜下观察,lnc-CCDC117-1呈现出绿色荧光,细胞核被DAPI染成蓝色。将图像合并可见lnc-CCDC117-1定位于细胞核内。说明lnc-CCDC117-1可能在细胞核中发挥作用。见图4。

图4 lnc-CCDC117-1 在细胞内的定位 ×40

2.4 敲低c-Myc对舌鳞癌细胞HN6/SCC9/CAL27中lnc-CCDC117-1表达的影响将shc-Myc转染至HN6/SCC9/CAL27细胞,qRT-PCR检测敲低c-Myc后HN6/SCC9/CAL27细胞内lnc-CCDC117-1的表达量,显示lnc-CCDC117-1水平均低于sh-ctrl组(t=14.13、68.24、11.59,P<0.001)。见图5。

图5 shc-Myc对HN6/SCC9/CAL27细胞中lnc-CCDC117-1表达的影响

2.5 过表达c-Myc对舌鳞癌细胞HN6/SCC9/CAL27中lnc-CCDC117-1表达的影响将+c-Myc转染至HN6/SCC9/CAL27细胞,qRT-PCR检测c-Myc过表达后的HN6/SCC9/CAL27细胞内lnc-CCDC117-1的表达量,显示lnc-CCDC117-1水平均高于转染ctrl组(t=9.513,P<0.001;t=29.71,P<0.001;t=5.309,P<0.01)。见图6。

图6 +c-Myc对HN6/SCC9/CAL27细胞中lnc-CCDC117-1表达的影响

2.6 shlnc-CCDC117-1干扰lnc-CCDC117-1和c-Myc的表达情况将sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1转染HN6/SCC9/CAL27细胞后,qRT-PCR检测显示转染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2组的lnc-CCDC117-1水平显著低于转染sh-ctrl组(t=5.781,P<0.01;t=9.176,P<0.001)、(t=5.931,P<0.01;t=13.940,P<0.001)、(t=7.362,P<0.01;t=4.359,P<0.05)。见图7。同样,转染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2组的c-Myc水平明显低于对照组(t=6.267,P<0.01;t=9.557,P<0.001)、(t=18.370,P<0.001;t=27.040,P<0.001)、(t=3.947,P<0.05;t=3.405,P<0.05)。见图8。

图7 shlnc-CCDC117-1对HN6/SCC9/CAL27细胞中lnc-CCDC117-1表达的影响

图8 shlnc-CCDC117-1对HN6/SCC9/CAL27细胞中c-Myc表达的影响

2.7 +lnc-CCDC117-1对lnc-CCDC117-1表达水

平的影响将+lnc-CCDC117-1转染HN6/SCC9/CAL27细胞,qRT-PCR检测显示转染+lnc-CCDC117-1组的lnc-CCDC117-1水平明显高于转染ctrl组(t=12.470,P<0.001;t=12.110,P<0.001;t=6.269,P<0.01)。见图9。

图9 +lnc-CCDC117-1对HN6/SCC9/CAL27细胞中lnc-CCDC117-1表达的影响

2.8 lnc-CCDC117-1对HN6/SCC9/CAL27细胞生长、增殖、侵袭能力的影响细胞生长曲线、CCK-8法、细胞迁移实验、克隆形成实验检测转染+lnc-CCDC117-1、sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2组后HN6/SCC9/CAL27细胞的生长增殖、迁移以及集落形成能力。结果表明,与ctrl组相比,+lnc-CCDC117-1组转染后48 h的细胞生长速率明显增加(t=14.440,P<0.001;t=4.909,P<0.05;t=16.140,P<0.01),见图10A、C、E;转染sh-lnc-CCDC117-1-1,sh-lnc-CCDC117-1-2组,细胞生长速率明显低于sh-ctrl组(F=48.360,F=19.210,F=17.020,P<0.01),见图10B、D、F 。CCK-8法实验显示+lnc-CCDC117-1组转染后24 h增值率明显上升(t=4.635,P<0.05;t=10.65,P<0.01;t=11.820,P<0.01),见图11A、C、E;转染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2组,细胞增殖明显减慢(F=148.600,F=11.530,F=143.800,P<0.01),见图11B、D、F。另外,与转染ctrl组比较,+lnc-CCDC117-1组转染后24 h后细胞迁移速率增加;转染sh-lnc-CCDC117-1-1、sh-lnc-CCDC117-1-2组,细胞迁移速率明显低于sh-ctrl组,见图12。+lnc-CCDC117-1组细胞形成集落的数量比ctrl组增多[(161.00±3.74)vs(214.67±9.29),t=7.581,P<0.01];与sh-ctrl组比较,转染sh1-lnc-CCDC117-1,sh2-lnc-CCDC117-1组的集落个数减少[(193.33±6.13)vs(109.33±5.56),(193.33±6.13)vs(85.00±3.56),F=239,P<0.001],见图13。 因此,可以看出过表达HN6/SCC9/CAL27细胞内lnc-CCDC117-1显著促进细胞增殖;反之,敲低HN6/SCC9/CAL27细胞中lnc-CCDC117-1明显抑制细胞增殖与迁移。

图10 生长曲线实验结果

图11 CCK-8细胞增殖实验结果

图12 细胞划痕实验 ×20

图13 结晶紫染色观察转染sh-lnc-CCDC117-1 、+lnc-CCDC117-1后CAL27细胞集落形成情况

3 讨论

OSCCs是世界上第6大最常见的恶性肿瘤[10],5年病死率约为50%。主要危险因素有吸烟、饮酒和人乳头状瘤病毒感染[11]。作为一种复杂的肿瘤性疾病,口腔鳞状细胞癌好发于口腔各个部位,其中以舌鳞癌最为常见。近些年来由于其恶性程度高、转移快、病死率高而预后较差成为临床治疗的难题,因此,随着肿瘤分子生物学发展,探究舌鳞癌发生的潜在通路机制联合基因治疗受到越来越多的关注[12]。

C-Myc被列为人类最重要的致癌基因之一。C-Myc的失调受多种病理条件干扰,包括基因组不稳定、免疫细胞逃逸,不受控制的细胞增殖、永生化、血管生成和转移等[13-14]。研究表明lncRNA在肿瘤中表达异常,c-Myc可以调控一些lncRNA的表达,而lncRNA 也能结合c-Myc抑制其表达,两者形成的lncRNA-c-Myc 网络影响了肿瘤的进程,在肿瘤的转移和激活中发挥关键作用。已有研究表明一些受c-Myc调控的lncRNA,例如在0SCC中,c-Myc上调 lncRNA NEAT1促进细胞的增殖进而提高 OSCC3 细胞的糖酵解代谢水平;舌鳞癌细胞SCC3中lncRNA55受c-Myc负调控,c-Myc敲低可以使lncRNA表达明显上调。另有研究[12]表明非小细胞肺癌H19是c-Myc的下游靶基因,c-Myc能上调H19表达, H19 进而下调miR-107促进肿瘤生长。Feng et al[15]研究表明lncRNA MILIP在人类癌症中上调,其表达与MYC表达水平呈正相关。MILIP通过抑制TRIML2,降低肿瘤蛋白p53的SUMO化促进细胞存活、增殖和致瘤性,最终导致肿瘤蛋白p53转化,表明MILIP可能是对抗c-Myc轴的抗癌靶点。该研究通过基因芯片技术,筛选出因c-Myc下调引起表达差异的lnc-CCDC117-1作为研究对象,探究c-Myc 与lnc-CCDC117-1的调控关系,并分析lnc-CCDC117-1对舌鳞癌细胞发展的影响。

为了验证舌鳞癌细胞中lnc-CCDC117-1与c-Myc表达之间的联系,建立双荧光素酶报告基因系统,结果显示,c-Myc增强了lnc-CCDC117-1野生型报告基因的相对活性,说明lnc-CCDC117-1可能是c-Myc的直接靶点, c-Myc对lnc-CCDC117-1的转录活性有调节作用。为了增加结果的可信度, PCR检测显示在HN6/SCC9/CAL27细胞中c-Myc上调lnc-CCDC117-1表达增加,下调后lnc-CCDC117-1表达量减少。结论与上述一致。该研究结果显示,在舌鳞癌细胞中lnc-CCDC117-1与c-Myc表达之间存在正相关性,推测lnc-CCDC117-1受c-Myc正调控。进一步探究lnc-CCDC117-1在舌鳞癌细胞中的生物学功能,体外构建表达载体sh-lnc-CCDC117-1-1,sh-lnc-CCDC117-1-2、+lnc-CCDC117-1,转染至HN6/SCC9/CAL27细胞,过表达、敲低lnc-CCDC117-1水平。通过 CCK-8法、细胞划痕等实验检测细胞增殖情况,结果均显示lnc-CCDC117-1表达上调能促进舌鳞癌细胞的增殖,反之则抑制细胞生长,说明lnc-CCDC117-1可调控影响癌细胞的生长。另外,荧光原位杂交实验显示lnc-CCDC117-1定位在舌鳞癌细胞核内,预测lnc-CCDC117-1在细胞核中发挥功能。

综上所述,该研究表明舌鳞癌细胞HN6/SCC9/CAL27中lnc-CCDC117-1受c-Myc 正调控,c-Myc参与调节lnc-CCDC117-1的转录活性。过表达lnc-CCDC117-1水平促进HN6/SCC9/CAL27细胞增殖、迁移能力,反之则会抑制细胞生长;并表明lnc-CCDC117-1存在于细胞核当中。但该实验研究尚处于初级阶段,对于c-Myc-lnc-CCDC117-1通路怎样从分子水平干扰细胞生长仍是未知的。继续深入研究lnc-CCDC117-1在舌鳞癌细胞中的抑制机制,将为口腔恶性肿瘤的靶向治疗提供新的思路和临床指导意义。