氧化石墨烯固定化溶菌酶的研究进展*

李 慧，庞姗姗，田家瑶，王云云，薛志飞，龚国利

(1 陕西科技大学设计与艺术学院，陕西 西安 710021；2 陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021)

GO虽然对溶菌酶具有良好的吸附作用，但GO与蛋白质的相互作用，会扰乱蛋白质结构的完整性，从而导致活性的降低[17-18]。Yang等[19]研究了溶菌酶在GO和RGO上的吸附，测定了载体对酶活性的抑制作用，与RGO相比，GO对溶菌酶活性表现出更强的抑制作用，GO诱导酶去折叠，导致α-螺旋结构丧失，色氨酸残基暴露于水环境中，GO浓度从2 μg/mL增加到18 μg/mL，溶菌酶的活性从93.8%降低至56.2%，RGO浓度从0 μg/mL增加到2 μg/mL，溶菌酶活性增加2.4%，当RGO浓度增加到18 μg/mL，仍保留初始酶活94.9%。Chakrabarti等[16]研究了鸡蛋清溶菌酶(HEWL)吸附在GO上对结构和功能的影响。结果显示，鸡蛋溶菌酶可以在GO上自发固定，固定后溶菌酶的二级和三级结构变化较小，但热稳定性和酶的活性显著降低。GO对溶菌酶活性和构象具有显著影响，GO固定溶菌酶，色氨酸残基(Trp)的环境变化影响酶的活性位点，对酶活性产生抑制作用。

本文综述近年来通过功能化修饰、包覆-吸附法、与天然高分子共混、位点特异性固定等方法，稳定GO对溶菌酶的吸附量，减少抑制酶活的原理、方法，并对未来该领域的发展方向做出展望。

1 GO固定化溶菌酶的途径

传统的固定化酶的方式有共价结合、物理吸附、交联、包埋四种。GO表面有丰富的含氧官能团，在固定溶菌酶时，主要有物理吸附法和共价结合法两种途径。

1.1 物理吸附法

GO作为载体，目前采用物理吸附法固定溶菌酶的应用较为广泛。物理吸附法是通过载体表面和酶分子表面之间的范德华力、离子键、氢键、疏水相互作用等分子间弱相互作用力达到酶固定目的的方法。这种酶固定方式实验条件便利，众多研究学者在固定溶菌酶时采用了物理吸附法。比如：Zhang等[20]通过静电吸附作用把溶菌酶固定在GO表面，然后将溶菌酶-GO共混到聚醚砜铸膜液中，通过相转化法制备了对大肠杆菌抑菌率可达68%的聚醚砜超滤膜。

1.2 共价结合法

共价结合法是通过共价键将酶表面的氨基酸残基与载体表面的活性基团连接，进行酶固定的方法。与物理吸附法相比，共价固定的酶稳定性更强，不易从载体表面脱离。这一方法要求载体上有较多的化学基团或者有较强的可修饰性，便于与酶分子结合。GO表面富含羟基，可以通过在载体表面引入氨基，再通过交联剂固定化酶。文献报道，溶菌酶可以通过共价结合法固定在壳聚糖表面[21-22]，壳聚糖分子中的游离氨基可通过双功能试剂戊二醛与溶菌酶发生偶联，固定后酶的最适pH降低0.5，最适温度升高5 ℃，热稳定性和贮藏稳定性的到提高。

2 固定化方法对溶菌酶吸附量及酶活性的影响

2.1 修饰-固定法对溶菌酶吸附量及酶活性的影响

纳米材料的化学功能化是一种成熟的技术，用于将所需的官能团接枝到其表面上，获得功能化改性纳米材料的方法。GO表面具有环氧基、羟基、羧基等多种含氧基团，利用这些活性含氧基团与其它试剂发生化学反应，如GO的氨基化[23]、蛋白质修饰[24]、化学还原[25]和聚乙二醇化[26]，可改善GO与生物分子之间的亲和力。

GO的氨基化对酶的稳定性有积极的影响，相比于GO，GO-NH对酶活性的影响更小。固定化酶的催化行为与其α-螺旋含量有关，α-螺旋含量是酶正确折叠的良好指标，虽然完整的α-螺旋结构并不能保证酶的活性，但这种二级结构元素的丢失通常会导致酶失活。Stamatis等[27]对比分析了脂肪酶固定在GO表面和氨基化GO表面时酶的α-螺旋含量，直接固定在GO表面，脂肪酶α-螺旋含量下降，而固定在氨基化GO表面时，脂肪酶α-螺旋含量却增加。氨功能化会在GO表面形成隔离层，减少载体的聚集，也有助于避免酶与载体的刚性碰撞。此外，氨功能化提高了GO表面的亲和性并引入大量氨基，有助于后续修饰过程的进行，也中和了GO的负电荷，减小了静电相互作用对酶活性的影响[28]。亲和固定可以避免随机固定化引起的构象变化，从而保证了酶的活性[29]。

牛血清白蛋白(BSA)通常用于控制蛋白质与各种固体表面的粘附，通过对BSA残基的化学修饰，控制其在GO表面的吸附，为酶在GO表面的结合提供了有利条件。Kumar等[30]将高度阳离子化的牛血清白蛋白(cBSA)吸附于GO表面，有效维持与GO结合后酶的结构和活性，GO经过cBSA修饰后，表面亲和力提高，可以有效保持固定化酶的活性，GO表面cBSA吸附量越多，载体对酶活的影响越小。

还原氧化石墨烯(RGO)是由GO经过反应去除一些氧化的官能团得到的，RGO有高比表面积、低电导率、高缺陷和亲水性等特性[31]。GO和RGO在不修饰或使用偶联剂的情况下，依靠氢键、静电、疏水、弱范德华力、π-π相互作用以及共价相互作用可以直接固定蛋白质，但这些相互作用会影响蛋白质的构象、活性和稳定性[20，25]。Yang等[19]比较了GO和RGO对溶菌酶构象和活性的影响。相较于RGO，GO对酶活性的抑制更为严重，而RGO对酶活性几乎没有影响；GO和RGO对溶菌酶活性的不同影响是由于它们诱导了酶构象发生了不同的变化；GO固定溶菌酶，降低了α-螺旋含量，酶二级结构丧失，活性位点暴露于水环境中，导致酶失活。RGO固定溶菌酶，α-螺旋含量却略有增加，表明RGO对溶菌酶的生物相容性高于GO。

聚乙二醇(PEG)是一种水溶性聚合物，被用于许多药物和生物技术应用中生物大分子和表面的修饰，作为一种间隔物，可以保护酶免受变性作用[26]。Wang等[32]合成了一种新型磁性多臂纳米复合材料GO@Fe3O4@6arm-PEG-NH2，并进行HRP的固定化研究，与游离酶相比，固定化HRP的热稳定性、贮存稳定性和操作稳定性均有提高；经8次循环后，固定化HRP的活性仍在68.1%以上。

2.2 包覆-吸附法对溶菌酶吸附量及酶活性的影响

包覆-吸附法也可以改善GO对酶的活性和稳定性的影响。Luo等[33]提出了一种原位自由基聚合技术与非共价吸附方法相结合的双固定化酶的方法，可有效提高酶的活性和稳定性。通过原位自由基聚合法在酶表面包裹N-烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)单体聚合物壳，形成带正电荷的NOPH10纳米球，可稳定酶的构象并保护其结构在固定化过程中不变形；同时该壳层结构可保护酶结构免受热效应的影响，提高酶的热稳定性。Griebenow等[34]研究了化学糖基化对酶在GO纳米片上固定后稳定性的影响。胆红素氧化酶(BOD)共价连接葡聚糖生成糖基化BOD，稳定蛋白质结构，用GO固定糖基化BOD时，酶结构基本不变。糖基化通过限制蛋白质迁移率来增加稳定性，有助于生成高度稳定的蛋白质-GO生物结合物，用于生物纳米技术领域。

2.3 共混对溶菌酶吸附量及酶活性的影响

壳聚糖、海藻酸钠、明胶等天然高分子材料是酶固定化研究中常用的传统载体，具有良好的生物相容性，可延长酶的寿命，提高酶的稳定性。GO和天然高分子材料的复合物可作为一种生物友好的生物相容性界面，用于固定生物分子，为生物分子提供良好的微环境，并有效地保持其活性[35-36]。GO表面的静电荷会使其聚集，用壳聚糖、海藻酸钠等材料与GO共混能防止GO聚集，增强其稳定性[37]。通过静电层层自组装、化学沉淀法、静电液滴法、自由基聚合法等方法，天然高分子材料与GO可以形成微球、纳米粒子、复合膜水凝胶、复合膜等复合材料，以这些复合材料为载体，不仅可以提高酶的吸附量，还可以提高固定化酶的活性、稳定性和重复利用性[36，38]。Xue和Wang[39-40]分别测试了新型羧甲基壳聚糖-GO杂化颗粒和功能性胍离子液体包覆的磁性壳聚糖GO对蛋白质的吸附性能，发现两种复合材料对溶菌酶均有良好的吸附性。He等[38]将GO包裹在海藻酸钠中，制备了钙离子交联的海藻酸钠/GO复合凝胶珠(Ca-SA/GO)，并将其用于对溶菌酶的吸附。GO的浓度越高，Ca-SA/GO对溶菌酶的吸附能力越好；CA-SA/GO经3个循环使用后，对溶菌酶的吸附能力仍保持在80%以上。Ca-SA/GO具有良好的稳定性、吸附能力和再生能力，是一种很有前途的溶菌酶吸附剂。

2.4 位点特异性固定对溶菌酶吸附量及酶活性的影响

GO固定溶菌酶导致酶失活的主要原因是酶构象的改变以及活性位点无法到达底物。位点特异性共价固定，允许酶以确定的、可控的方式排列，通过形成亲和键来改善一些缺点。GO经表面修饰之后，可以避开酶的活性位点，实现定向固定化酶，减少对酶活的损失。Bundy等[41]在不同条件下，将T4溶菌酶分别固定在离活性位点近和远位置，比较了两种情况下酶的活性和稳定性。结果表明，定向共价固定化酶的活性和稳定性超过传统随机共价固定化酶。经过严格的冻融三次和化学变性处理后，位点特异性固定化酶的活性比随机固定化酶高50%和73%。酶的定向固定在酶活性和稳定性中起着重要作用，通过控制酶的固定化取向，可避免载体与酶活性位点的之间接触并有效降低固定酶活性位点的空间位阻效应，提高酶的活性和稳定性。

3 结 语

固定化酶有效提高了酶的稳定性和重复利用率，在众多工业生产中发挥重要作用，有利于酶的工业化，是酶工程领域的研究热点[42]。用GO直接固定溶菌酶，会导致酶结构的变化，影响酶的催化活性，但通过GO表面的氨基化、生物胶修饰、化学还原、聚乙二醇化等功能化修饰，可明显改善其表面的生物相容性，调控与酶之间的相互作用，减小对溶菌酶构象和活性的影响；通过氧化石墨与天然高分子材料的共混，形成具有生物相容性界面的复合材料，有效保持了溶菌酶在固定化后的酶活；GO或溶菌酶通过包覆-吸附的方式，可有效避免酶与载体的直接接触所导致的酶活损失；位点特异性固定避开了酶的活性位点，避免了固定化过程对酶活性的影响。

GO具有多种优良的特性，在食品、生物医药、生物传感器、纺织品、酶固定等领域应用广泛，未来，要继续开发既能提高酶吸附量，又能提高酶活性的改性GO材料以及GO的复合材料，进一步推进GO在固定化酶领域的应用。