黄芪桂枝五物汤对糖尿病大鼠心肌梗死后心肌重塑及TGF-β1/Smad3通路的影响

彭奋飞,陈月银

(广东省第二中医院,广东 广州 510095)

糖尿病是目前临床中常见的代谢疾病,如果血糖长期控制不佳,可导致心肌梗死等多种心血管疾病发生[1-2]。心肌梗死发生后,心肌组织因缺血损伤会引发心室壁增厚、心室容积改变等心肌重塑[3-4],严重影响患者心功能,危及患者生命。转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad3通路是细胞生长及增殖过程中的重要信号通路,与心肌重塑的发生及进展密切相关[5-6],调节该通路可能是抑制心肌重塑的有效途径。黄芪桂枝五物汤是经典名方,动物实验证实该方对糖尿病周围神经病变有明显保护作用[7-8],其对糖尿病心肌梗死后心肌重塑是否有影响尚不明确。本实验基于TGF-β1/Smad3通路探讨了黄芪桂枝五物汤对糖尿病大鼠心肌梗死后心肌重塑的影响,旨在为糖尿病合并心肌梗死后心肌重塑的治疗提供新的思路。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠72只,8周龄,体重200～220 g,购自广东至远生物医药科技有限公司,许可证号:SCXK(粤)2021-0057。大鼠饲养于广东省第二中医院实验动物房,温度20～24 ℃,相对湿度40%～70%,适应性喂养1周后进行实验。本实验经广东省第二中医院实验动物中心伦理委员会批准,充分保障了实验动物的福利。

1.2试剂 黄芪桂枝五物汤由黄芪9 g、桂枝9 g、芍药9 g、生姜18 g、大枣4枚组成,药材饮片购自北京同仁堂药业(批号分别为190902,191011,191126,190809,191105),将药材饮品置于1 500 mL水中浸泡4 h,煎煮1.5 h,过滤,将药材残渣再次置于1 000 mL水中煎煮1 h,过滤,合并2次滤液,浓缩成生药含量为1 g/mL,备用;福辛普利(中美上海施贵宝制药有限公司,批号:191101);链脲佐菌素(STZ,货号:IS0250)、牛血清白蛋白(货号:A8010)购自北京索莱宝科技有限公司;BCA试剂盒(碧云天生物科技有限公司,货号:P0012);一氧化氮(NO)试剂盒(上海晅科生物科技有限公司;货号:XK-E10867);内皮型一氧化氮合酶(eNOS)试剂盒(货号:YLK-EDS338,优利科生命科学有限公司);丙二醛(MDA)试剂盒(货号:ER1878,武汉菲恩生物科技有限公司);内皮素(ET)试剂盒(货号:EK-R37841,北京博沃尔斯生物科技有限公司);RNA提取试剂盒(货号:R0011)及PCR试剂盒(货号:D7260)购自碧云天生物科技公司;GAPDH(货号:ab181602)、TGF-β1(货号:ab215715)、Smad3(货号:ab40854)兔抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(货号:ab6734)购自艾博抗(上海)贸易有限公司;p-Smad3兔抗体(货号:abs130987)购自爱必信生物科技有限公司;PCR引物设计及合成(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.3设备及仪器 Sigma Vet超声诊断仪(上海玉研科学仪器有限公司);Microvent小动物呼吸机(上海玉研科学仪器有限公司);EZⅢ血糖仪(艾康生物技术有限公司);BS-350S全自动生化分析仪(南京贝登医疗股份有限公司);GIS-500凝胶成像仪(杭州米欧仪器有限公司);DMi8荧光倒置显微镜(德国Leica公司)。

1.4实验方法 随机取大鼠12只作为空白组,其余大鼠首先参照文献[9]方法建立糖尿病模型:高糖高脂饲料喂养8周后,腹腔注射STZ 65 mg/kg,72 h后大鼠禁食12 h,取尾静脉血测定血糖,以血糖>11.1 mmol/L视为造模成功。糖尿病造模完成后,参照文献[10]方法进行心肌梗死模型的建立:大鼠禁食8 h后使用异氟烷进行麻醉,胸部备皮,消毒,开放胸腔,连接呼吸机,设定潮气量为40 mL/kg,呼吸频率为60次/min,呼吸比率1∶2,使用尼龙绳结扎冠状动脉前降支,关闭胸腔同时吸尽胸腔空气,保持胸腔负压,并按照20 000 IU/kg剂量腹腔注射庆大霉素,1次/d,连续3 d。将50只造模成功大鼠随机分为模型组、福辛普利组及黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量组,每组10只。黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量组分别给予黄芪桂枝五物汤2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg灌胃(给药剂量参考文献[7]设定),福辛普利组给予福辛普利4 mg/kg灌胃(给药剂量参考文献[11]设定),空白组及模型组给予等量生理盐水灌胃,均1次/d,连续8周。

1.5检测指标及方法

1.5.1心功能指标 末次灌胃24 h后,将大鼠麻醉并仰卧位固定在操作台上,使用超声诊断仪测定左心室短轴缩短率(LVFS)及左心室射血分数(LVEF),每只大鼠测量3次。

1.5.2血清心肌损伤指标及血糖、糖化血红蛋白水平 超声检测后,取腹主动脉血3 mL,使用全自动生化分析仪测定肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、脑钠肽(BNP)、血糖及糖化血红蛋白水平。

1.5.3心肌组织中NO、eNOS、MDA及ET含量颈椎脱臼处死大鼠,分离心肌组织,研磨匀浆并充分裂解后,4 ℃下8 000 r/min离心10 min,取上清液,使用ELISA试剂盒测定NO、eNOS、MDA、ET含量。

1.5.4心肌组织病理学形态 取大鼠梗死区心肌组织,置于4%中性甲醛中固定,石蜡包埋后制成5 μm切片,HE染色并在显微镜下观察。

1.5.5心肌组织中TGF-β1及Smad3蛋白表达情况 取大鼠梗死区心肌组织,用组织裂解液充分裂解,提取总蛋白,BCA试剂盒定量后取蛋白含量为40 μg的裂解液,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转移到聚偏氟乙烯膜上,牛血清白蛋白封闭后,4 ℃条件下使用GAPDH、TGF-β1、Smad3、p-Smad3兔抗体(1∶500稀释)孵育过夜,TBST清洗后,山羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)室温下孵育1 h,TBST再次清洗后,滴加ECL化学发光液,凝胶成像仪成像后,使用Image J 1.8.0按照灰度值进行定量分析。

1.5.6心肌组织中TGF-β1mRNA表达情况 使用RNA提取试剂盒提取心肌组织总RNA,反转录为cDNA后测定。引物序列:TGF-β1正向引物为5’-CTCTGTGACTCGTGGGAT-3’,反向引物为5’-CACTTGTTGGCTTATGTTCT-3’,长度为104 bp;GAPDH正向引物为5’-TCTCTGCTCCTCCC-3’,反向引物为5’-ACACCGACCTTCAC-3’,长度为67 bp。采用20 μL反应体系:PCR Master Mix 10 μL,正反向引物各0.8 μL,模版DNA 2 μL,蒸馏水补充至20 μL。反应程序:预变性92 ℃ 3 min,92 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,共计35个循环。结果以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。

2 结 果

2.1各组大鼠LVFS及LVEF比较 模型组大鼠LVFS及LVEF均明显低于空白组(P均<0.05);黄芪桂枝五物汤各组及福辛普利组大鼠LVFS及LVEF均明显高于模型组(P均<0.05),且黄芪桂枝五物汤各组LVFS及LVEF呈剂量依赖性增高,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和糖尿病心肌梗死各组大鼠LVFS及LVEF比较

2.2各组大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血红蛋白水平比较 模型组大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血红蛋白水平均明显高于空白组(P均<0.05);黄芪桂枝五物汤各组及福辛普利组大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血红蛋白水平均明显低于模型组(P均<0.05),且黄芪桂枝五物汤各组血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血红蛋白水平均呈剂量依赖性降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组和糖尿病心肌梗死各组大鼠血清CK、CK-MB、BNP及血糖、糖化血红蛋白水平比较

2.3各组大鼠心肌组织中NO、eNOS、MDA、ET含量比较 与空白组比较,模型组大鼠心肌组织中NO、eNOS含量均明显降低(P均<0.05),MDA及ET含量均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,黄芪桂枝五物汤各组及福辛普利组大鼠心肌组织中NO、eNOS含量均明显升高(P均<0.05),MDA及ET含量均明显降低(P均<0.05);且黄芪桂枝五物汤各组NO、eNOS含量均呈剂量依赖性升高,MDA及ET含量均呈剂量依赖性降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3。

表3 空白组和糖尿病心肌梗死各组大鼠心肌组织中NO、eNOS、MDA、ET含量比较

2.4各组大鼠心肌组织病理学表现 空白组大鼠心肌组织无明显病理改变;模型组大鼠心肌组织水肿,有明显炎症浸润及坏死;与模型组比较,黄芪桂枝五物汤各组及福辛普利组大鼠心肌组织炎症坏死明显减轻,心肌组织细胞排列较整齐。见图1。

图1 空白组和糖尿病心肌梗死各组大鼠心肌组织病理学形态(HE染色,×200)

2.5各组大鼠心肌组织中TGF-β1及Smad3蛋白表达情况比较 模型组大鼠心肌组织中TGF-β1及p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);黄芪桂枝五物汤各组及福辛普利组大鼠心肌组织中TGF-β1及p-Smad3/Smad3蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),且黄芪桂枝五物汤各组TGF-β1及p-Smad3/ Smad3蛋白相对表达量均呈剂量依赖性降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

图2 空白组和糖尿病心肌梗死各组大鼠心肌组织中TGF-β1及Smad3 蛋白表达情况

2.6各组大鼠心肌组织中TGF-β1mRNA相对表达量比较 模型组大鼠心肌组织TGF-β1mRNA相对表达量明显高于空白组(P<0.05);黄芪桂枝五物汤各组及福辛普利组TGF-β1mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),且黄芪桂枝五物汤各组TGF-β1mRNA相对表达量均呈剂量依赖性降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 空白组和糖尿病心肌梗死各组大鼠心肌组织中TGF-β1 mRNA相对表达量

3 讨 论

心肌梗死是糖尿病患者常见的心血管并发症之一,心肌梗死发生后会激活体内肾素-血管紧张素系统,导致心率加快,心肌细胞增生肥大,心室壁增厚,心室容积减小等心肌重构,心肌重构发生后,心肌细胞节律异常,会导致射血分数降低,造成心肌细胞进一步损伤[12-13]。樊国亮等[14]研究表明,血糖升高会导致心肌梗死模型兔心肌重构加速,纤维化加重;黄妍等[9]研究报道,糖尿病心肌梗死大鼠存在明显心室重构,TGF-β1/Smads信号通路激活参与病情的发生发展,抑制TGF-β1/Smads信号通路可减轻心室重构和心肌病理损伤。

黄芪桂枝五物汤具有益气温经、和血通痹的作用,方中黄芪健脾补中、益卫固表;桂枝发汗解表、通阳化气;芍药养血和营;生姜解表散寒;大枣补中益气、养血安神。凌金颖等[15]和周雯等[16]研究表明,黄芪桂枝五物汤具有显著的抗炎及神经保护作用。韦玉娜等[17]报道,黄芪桂枝五物汤合生脉饮加减能够显著改善糖尿病心肌病患者心功能,抑制心肌组织纤维化和心肌重塑。本实验结果显示,黄芪桂枝五物汤各组大鼠LVFS及LVEF明显高于模型组,血清CK、CK-MB、BNP、血糖及糖化血红蛋白水平明显低于模型组,提示芪桂枝五物汤能够显著改善糖尿病心肌梗死大鼠的心功能,减轻心肌损伤,且有降糖作用。

NO、ET是血管内皮细胞分泌的活性物质,维持血管的舒缩平衡,NOS是合成NO的前体物质,eNOS是NOS的亚型之一,其能够改善心肌梗死后血管的生成并调节心室功能。心肌梗死后血管内皮受损,导致NO合成减少,ET释放增多,而ET与心肌梗死后心肌重塑的发生有关,其水平升高提示预后不良[18-19]。MDA是氧自由基代谢产生的脂质过氧化物,其水平升高提示组织细胞氧化损伤[20]。本实验结果显示,模型组大鼠心肌组织中NO、eNOS含量明显降低,MDA及ET含量明显升高;与模型组比较,黄芪桂枝五物汤各组大鼠心肌组织中NO、eNOS含量明显升高,MDA及ET含量明显降低。提示黄芪桂枝五物汤能够减轻心肌组织自由基损伤,抑制心肌重塑。

TGF-β1/Smad3通路与细胞生长、分化、增殖等密切相关,TGF-β1作为一种细胞调节因子,能够与细胞内相应受体结合,形成复合物,进而激活下游Smad3相关蛋白,Smad3蛋白被激活后,移入细胞核内,进而激活胶原蛋白,导致胶原蛋白沉积,诱导纤维化的发生[21]。潘海敏等[22]研究证实TGF-β1/Smad3通路参与大鼠心肌细胞肥大及间质增生等病理过程,而抑制心肌组织TGF-β1、p-Smad3蛋白表达则能够显著改善心肌重塑;赵地等[23]研究表明,TGF-β1、p-Smad3升高与心力衰竭大鼠心室重构及心肌纤维化有关,调控TGF-β1/Smad3通路可明显抑制心室重构及心肌纤维化;闫娜等[24]研究发现,TGF-β1/Smad3通路参与急性心肌梗死大鼠的心室重塑,抑制TGF-β1/Smad3通路可减少心肌组织炎性细胞浸润和胶原蛋白沉积。本实验结果显示,模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3蛋白表达量及TGF-β1mRNA表达量均显著升高,黄芪桂枝五物汤各组大鼠心肌组织中TGF-β1、Smad3蛋白表达量及TGF-β1mRNA表达量均明显低于模型组,提示黄芪桂枝五物汤能够抑制糖尿病心肌梗死大鼠TGF-β1/Smad3通路,进而抑制心肌重塑。

综上所述,黄芪桂枝五物汤能够抑制糖尿病大鼠心肌梗死后心肌重塑,抑制心肌组织氧化损伤,改善大鼠心功能,且可控制血糖水平,其机制可能与调节TGF-β1/Smad3通路有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。