D152树脂对多粘菌素E的提取性能研究

赵振中,李海超

(河北圣雪大成唐山制药有限责任公司,河北 唐山 064000)

多粘菌素E为白色或类白色粉末,味苦、无臭,易溶于水、苯甲醇,微溶于甲醇,不溶于丙酮和乙醚等,其游离碱微溶于水,目前市售产品为其硫酸盐。多粘菌素E由多粘芽孢杆菌发酵产生,是1种多肽类抗生素,包含多种氨基酸和脂肪酸;其硫酸盐为硫酸多粘菌素E,有较好的热稳定性,在pH 3.0～7.5内较稳定。作为抗生素,多粘菌素E与细胞膜结构中的游离氨基酸和细胞膜中游离的磷酸根发生作用,增加细胞膜通透性,从而杀死细菌[1-2]。

多粘菌素E的提取方法主要有溶剂萃取法[3]、泡沫分离法[4]、活性炭吸附法、沉淀法[5-7]、离子交换法[8-10]等,其中离子交换法因易获得纯度较高的产品、成本低而得到广泛应用。目前制药企业对多粘菌素E的提取工艺主要是:发酵液过滤—树脂吸附—硫酸洗脱—洗脱液后处理。目前用离子交换法提取多粘菌素E的研究主要是利用溶解多粘菌素E成品得到的溶液进行条件优化选择。但在实际生产中,发酵过滤液的组分复杂,不仅存在大量的残糖、蛋白质、色素等有机分子,也存在大量的Ca2+、Mg2+、Fe3+等无机离子,这些物质均会对吸附过程造成影响,导致收率损失和产能降低。D152树脂为强碱弱酸型阳离子交换树脂,对抗生素具有良好的吸附作用[11]。研究D152树脂吸附多粘菌素E的特性,旨在优化多粘菌素E的生产工艺,提高产品质量,为发挥现有生产装备最大产能提供生产控制参数。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:Waters e2695-2489高效液相色谱仪,pHS-3C型精密酸度计,电子天平(美加宁MJN-681),机械搅拌器,陶瓷膜(上海奥赛分离技术工程有限公司),水环真空泵,自制离子交换柱。

主要试剂:HCl、H2C2O4·2H2O、H2SO4、NaOH、EDTA-2Na、氨水、NH4Cl、Na2SO4等,均为分析纯;试验用水为自制无盐水;D152树脂(核工业北京化工冶金研究院):湿视密度0.8 g/mL,粒度(0.27～1.0 mm)90%,水分70.4%。

试验样品:多粘菌素E发酵液(河北圣雪大成唐山制药有限责任公司)。

1.2 树脂预处理

将D152树脂交替用4.0%盐酸和3.0%氢氧化钠溶液浸泡再生3次,每次浸泡后用无盐水洗树脂至pH≥3.0(盐酸浸泡时)或pH≤11.60(氢氧化钠溶液浸泡时),备用。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵液预处理

取发酵液,按照草酸质量与发酵液体积比5∶1 g/L,加入H2C2O4·2H2O,搅拌30 min后经陶瓷膜过滤处理,收集过滤液。按照试验要求稀释和调整pH。

1.3.2 过滤液pH对吸附系统的影响

在25 ℃下,取200 mL过滤液,用1 mol/L的NaOH调节溶液pH为4.0～8.0,控制机械搅拌器转速为1 000 r/min,每1 h采用HPLC法检测效价,研究pH对多粘菌素E过滤液效价的影响。

根据现有生产参数,将处理好的D152树脂采用单柱湿法装柱,控制径高比为2∶5;料液温度为25 ℃。用3.0% NaOH溶液将过滤液pH调整至4.5、5.0、6.0、7.0、8.0,然后在吸附流速1.0 BV/h条件下进行吸附,待出口浓度与进口浓度相等时,吸附结束,计算每mL湿树脂的吸附量。

1.3.3 过滤液效价对D152树脂吸附量的影响

根据现有生产工艺设备进行动态吸附试验。单柱湿法装柱,树脂装量径高比为2∶5,试验温度为25 ℃,吸附流速1.0 BV/h,过滤液pH 6.0～7.0。分别将过滤液效价稀释至25、30、35、40万U/mL进行动态吸附,待出口浓度与进口浓度相等时,终止试验,绘制吸附量曲线。

1.3.4 吸附流速优化

吸附流速和吸附量的平衡点影响产能的高低。因此,对吸附流速进行研究,选择更适合D152树脂的吸附流速。选择单柱湿法装柱,树脂装量径高比为2∶5,试验温度为25 ℃,过滤液效价为32万U/mL、硬度为400 μg/mL、pH 6.0～7.0,控制吸附流速为1.0、2.0 BV/h,待出口效价与进口效价相等时,终止试验。绘制穿透曲线和吸附曲线。

1.3.5 洗脱剂浓度优化

以稀硫酸作为洗脱剂,按照1.0 BV/h流速进行洗脱。在25 ℃条件下,研究洗脱剂浓度对D152树脂洗脱效果影响。选择在过滤液效价30万U/mL、pH 7.0、吸附流速1.0 BV/h条件下动态吸附饱和且清洗完毕的D152树脂柱,进行洗脱试验,洗脱液浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5 mol/mL,绘制洗脱曲线。

1.3.6 洗脱剂流速优化

取吸附饱和且清洗完毕的D152树脂进行装柱,选取1.3.6得到的最佳洗脱剂浓度,以不同的洗脱流速(0.5、1.0、1.5 BV/h)进行洗脱试验,绘制洗脱曲线。

1.3.7 生产工况性能评价

根据上述优化条件调整生产工艺参数,从产能、物料质量、收率、树脂运行情况等方面进行综合评价。生产采用3柱串联吸附工艺,依过滤液流向分别作为主、副、次交换柱,吸附方式采用自下而上的反进吸附方式,切换周期8 h。

1.4 检测方法

使用高效液相色谱法对多粘菌素E的效价进行检测,具体测定方法参考2020版兽药典[12]。按照《水质 钙和镁总量的测定 EDTA滴定法》(GB/T 7477—1987)检测溶液总硬度[13]。

1.5 计算公式

吸附收率=(c1V1-c2V2)/c1V1×100%,

洗脱收率=c3V3/(c1V1-c2V2)×100%,

总收率=吸附收率×洗脱收率,

式中:c1—过滤液效价,U/mL;c2—吸附废水效价,U/mL;c3—洗脱液效价,U/mL;V1—过滤液体积,mL;V2—吸附废水体积,mL;V3—洗脱液体积,mL。

2 试验结果与讨论

2.1 过滤液pH对吸附系统的影响

多粘菌素E在不同pH条件下,效价随时间变化情况见图1。多粘菌素过滤液效价在pH 6.0～7.0范围内稳定性较好,在碱性条件下降解严重,这与文献[14-16]表述一致。

图1 过滤液pH对多粘菌素E稳定性的影响Fig. 1 Effect of filtrate pH on the stability of polymyxin E

D152树脂在不同pH条件下的吸附量见图2。可以看出,D152树脂的吸附量随着过滤液pH的升高而明显增加。这是由于D152树脂上的—COONa为弱酸性基团,其电离程度受溶液pH影响很大,尤其是在强酸性条件下很难发生离子交换反应,所以D152树脂的吸附量随溶液pH下降而减小,随pH升高而增加。在实际应用中考虑到多粘菌素E的稳定性,将过滤液pH控制在6.0～7.0内进行吸附。

图2 过滤液pH对D152树脂吸附量的影响Fig. 2 Effect of filtrate pH on adsorption capacity of D152 resin

2.2 过滤液效价对吸附量的影响

过滤液效价是影响产能和D152树脂吸附量的重要因素之一。模拟了动态吸附条件下,过滤液效价对D152树脂吸附量的影响,结果见图3～图4。可以看出,过滤液效价在25～40万U/mL,D152树脂吸附量呈缓慢递增趋势;效价大于30万U/mL以后,D152树脂吸附速率基本不增加。

图3 过滤液效价对D152树脂吸附量的影响Fig. 3 Effect of filtrate titer on adsorption capacity of D152 resin

图4 D152树脂吸附曲线Fig. 4 D152 resin adsorption curve

分析其原因,认为是由于在过滤液效价较低时,离子交换速率主要是由外扩散控制,此时浓度增加,交换速率也会增加;但随着效价增加,交换速率受内扩散和外扩散同时作用,此时交换速率增加缓慢;继续增加过滤液效价,离子交换过程主要受内扩散控制,交换速率到达极限,此时会造成收率损失。所以实际生产过程中,为了同时保证吸附收率和产能,过滤液效价应尽可能控制在30万U/mL左右。

2.3 过滤液流速对吸附量的影响

过滤液流速对D152树脂吸附量的影响见图5～图6。

图5 不同流速下D152树脂的穿透曲线Fig. 5 Penetration curves of D152 resin at different flow rates

图6 过滤液流速对D152树脂吸附量的影响Fig. 6 Effect of filtrate flow rate on adsorption capacity of D152 resin

从图5可看出,在1.0 BV/h流速下吸附8 h,出口溶液的效价为900 U/mL,而2.0 BV/h流速吸附8 h出口效价为5 000 U/mL左右,说明过滤液效价增加至30万U/mL,D152树脂性能完全满足生产要求(1.0 BV/h)。在常温稀溶液中,离子的化合价越高,越易被交换[17]。多粘菌素E在溶液状态下呈+5价,所以随着吸附过程的进行,多粘菌素E会置换已经被吸附的Ca2+、Mg2+,因此出口溶液的硬度会增加(图6)。但随着多粘菌素E吸附量的增加,出口溶液的效价不可控,造成收率损失。虽然较低流速能够增加吸附量,但会降低生产效率,所以选择1.0 BV/h流速作为吸附上柱流速。

2.4 洗脱剂浓度选择

洗脱剂浓度对洗脱液出口效价的影响见图7～图8。

图8 洗脱剂浓度对洗脱液pH的影响Fig. 8 Effect of eluent concentration on eluate pH

从图7～图8可看出,0.2 mol/L硫酸的洗脱曲线出现明显的拖尾现象,洗脱时间较长,影响进度与产能;而0.5 mol/L硫酸的洗脱曲线,高效价集中,但pH下降较快,过低的pH会增加后续的中和难度,增加处理成本。所以洗脱剂以0.3～0.4 mol/L硫酸为宜。

2.5 洗脱剂流速优化

选择动态吸附试验考察洗脱剂流速对D152树脂吸附多粘菌素E的影响。不同流速下的洗脱曲线见图9。

图9 单柱洗脱曲线Fig. 9 Single column elution curve

从图9可看出,当洗脱液流速在1.0～1.5 BV/h时,洗脱曲线峰型较好,没有出现明显的拖尾;当洗脱流速为2.0 BV/h时,虽能较快回收高效价段,但拖尾比较明显,且pH降低较快。所以确定适宜的洗脱液流速为1.0～1.5 BV/h,此时洗脱液效价较高且pH较为适中,有利于后续工艺进行。

2.6 生产工况性能评价

2.6.1 运行评价

在3柱串联吸附工艺下,相比第1吸附周期,D152树脂的第2周期和第3周期的平均吸附量分别增加25.90%和53.85%。从洗脱曲线来看,在8 h切柱周期内,洗脱液总pH在2.0左右,高效价段较为集中。连续运行周期内各柱吸附量变化和洗脱曲线见图10～图11。

图10 不同周期吸附量Fig. 10 Adsorption capacity of different cycles

图11 周期内各柱洗脱曲线Fig. 11 Elution curve of each column in the period

2.6.2 收率评价

根据生产数据统计:吸附平均收率为98.96%,洗脱平均收率为99.18%,提取总收率为98.15%。可以看出,D152树脂对多粘菌素E提取效果良好,平均收率达98.0%以上。收率损失主要包括:1)吸附废水中约有0.3%～0.5%的损失;2)在实际生产过程中,D152树脂碱性再生pH控制在11.60以下(否则耗水量将急剧增加),碱性较强的环境会造成多粘菌素E变性,导致收率损失。

2.6.3 D152树脂性能评价

为了考察D152树脂在实际生产中的性能变化,在树脂运行6个月时进行了理化性能分析检测,并将检测结果与新树脂指标对比(表1)。

表1 D152树脂运行6个月前后理化性能对比Table 1 Comparison of physicochemical properties of D152 resin before and after 6 months operation

从表1可看出,D152树脂在运行6个月后,理化性能指标基本保持稳定。由于受反洗操作影响,树脂在使用过程中会出现磨损;但树脂交换当量变化不大,与新树脂相当。

3 结论

用D152树脂提取多粘菌素E时,控制过滤液效价30万U/mL、pH 6.0～7.0、吸附流速1.0 BV/h、树脂装量径高比2∶5、洗脱剂硫酸浓度0.3～0.4 mol/L、洗脱流速1.0～1.5 BV/h,采用3柱串联吸附工艺,更适合现有生产设备。此时,D152树脂吸附量可达680万U/mL湿树脂,洗脱液pH≥1.80,总收率≥98.0%,得到的洗脱液效价稳定。