结肠癌患者血清中miR-653-5p的表达及其临床意义

杨程晴，崔永辉，郑紫恒

（新乡医学院附属商丘市第一人民医院消化内科，河南 商丘 476100）

结肠癌是一种高度恶性的消化道肿瘤，具有较高发病率和死亡率[1]，对人类的健康构成重大威胁，全球每年新发的结肠癌病例超过100万，大约有70万人因该病死亡[2]。在中国，结肠癌患者总体5年生存率低于40%[3]。结肠癌早期具有隐匿性，通常被发现时已处于中晚期，而且容易复发和转移，虽然结肠镜检查的广泛使用改善了早期部分患者预后，但并不能显著降低结肠癌的总体死亡率[4]。主要原因是对结肠癌的发病机制还未被完全了解。结肠癌发生发展离不开致癌基因失活和原癌基因激活，是一个多因素、多线条和多基因的过程[5]。微核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类非编码RNA，长度约为21～25 nt，通过填充目标mRNA的3'非翻译区（3'-UTRs）来抑制或降解目标基因[6]。许多miRNAs已被证实在癌症组织或细胞中表达异常。这些失调的miRNA 在消化道恶性肿瘤的转移、复发和耐药性中起着重要作用[7-8]。其中miR-653-5p被发现在一些恶性肿瘤包括乳腺癌[9]、胃癌[10]和鼻咽癌[11]中具有重要作用，但miR-653-5p在结肠癌中的表达和作用尚不清楚。因此，本研究检测了结肠癌患者血清中miR-653-5p 的表达水平，分析其与结肠癌临床病理指标的相关性，评估其表达水平在结肠癌患者生存预后中的临床价值，拟为结肠癌的诊疗提供新的生物参考靶点。

1 材料与方法

1.1 研究对象一般资料

选取2019 年1 月—2020 年1 月商丘市第一人民医院门诊和住院共76名结肠癌患者作为实验组，年龄范围为20～80岁，平均（58.43±11.59）岁，其中男性和女性患者各38 例。另选择同时期到该院的正常体检者76名作为对照组，对照组人群年龄和性别与实验组相匹配。此研究通过商丘市第一人民医院伦理委员会审核（批准文号20200017），所有参与者均知情同意，并签署同意书。

实验组患者纳入标准：①符合《结肠癌标准治疗指南（试行）》的标准，并有结肠癌的病理诊断；②未接受过任何放、化疗或靶向治疗；③均拟行手术治疗；④有较为完整的临床资料和随访信息。排除标准：①同时合并其他恶性肿瘤疾病；②肝肾功能受损，患有严重的精神疾病和慢性病；③缺乏临床病理数据或治疗中断。

1.2 主要试剂

DP501 型血清miRNA 提取分离试剂盒、AG11743 miRNA cDNA 第一链合成试剂盒、B532461型miRNA 荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）检测试剂盒，均购自于美国Thermo Fisher 科技公司。miRNA-653-5p 特异性引物由美国Beckman 有限公司合成，miR-653-5p 上游引物为5'-GTGTT GAAACAATCTCTACTG-3'，下游为5'-GAACATGTC TGCGTATCTC-3'；U6 上游引物为5'-CTCGCTTCGG CAGCACA-3'，下游为5'-ACGCTTCACGAATTTGCG TGTC-3'。QuantStudio5 型qPCR 仪购自美国Roche公司。

1.3 样本的采集及血清中miRNA提取

采集研究对象5 mL 外周静脉血于含有EDTA无RNA 酶的采血管中，混合后在4 ℃条件下以3 000 r/min 离心10 min，吸取上清液并在-80 ℃条件下保存。采用miRNA提取试剂盒，严格按照试剂盒说明书步骤从血清中提取总miRNA，置于-80 ℃条件下保存备用。

1.4 qPCR扩增

把反转录酶2 μL、10×酶混合物5 μL、5×缓冲液4 μL、cDNA 模板2 μL、混合引物2 μL 和miRNA 6 μL，用无酶水（RNase-Free ddH2O）配制成反转录体系25 μL，于37 ℃作用60 min，95 ℃反应5 min，将miRNA反转录成cDNA后，置于-20 ℃保存。qPCR反应条件为95 ℃初始变性10 min，随后95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40个循环，最后72 ℃延伸50 s。采用SYBR染料法测定miR-653-5p的CT值，以U6作为内参，采用2-ΔΔCT计算各组样本血清中miR-653-5p 的相对表达水平，实验重复3次，并取平均值进行统计。

1.5 随 访

通过电话或定期门诊的形式，从术后第1 天对结肠癌患者进行长达36个月的随访，记录疾病的持续情况及患者的生存时间，并计算实验组结肠癌患者的生存率，76 例结肠癌患者中26 例随访期内幸存，50 例死亡。

1.6 统计学方法

使用SPSS 27.0 软件进行统计分析和Rstudio 软件制图。定量资料以±s表示；定性资料采用百分率表示。分别采用t检验分析miR-653-5p 表达水平的差异，χ2检验分析miR-653-5p 与病理指标的关联，Kaplan-Meire 方法绘制患者生存曲线，Log-rank 法比较两组患者生存率的差异，COX回归分析影响结肠癌患者预后的独立危险因素。

2 结 果

2.1 血清中miR-653-5p的表达水平

血清中miR-653-5p 相对表达水平在对照组健康人群中为0.471±1.076，在实验组结肠癌人群中为0.622±1.319，实验组结肠癌患者血清中miR-653-5p的表达水平较对照组明显降低（P＜0.01），见图1。

图1 结肠癌患者血清中miR-653-5p的相对表达水平

2.2 miR-653-5p表达水平与临床病理指标的关系

根据实验组患者miR-653-5p 表达水平的平均值（0.471）将结肠癌患者分为高、低表达组。结果高、低表达组分别有40 和36 人。经统计分析显示，miR-653-5p 表达水平与肿瘤分化程度、不同临床T 分期、有无淋巴结转移、有无远处转移、有无脉管癌栓存在明显相关关系（均为P＜0.01），而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小无明显相关关系（P＞0.05），见表1。

表1 结肠癌患者血清中miR-653-5p 的表达水平和临床病理指标的关系

2.3 miR-653-5p对于结肠癌的诊断价值

受试者工作特征曲线 （receiver operating characteristic curve，ROC）分析结果显示，根据miR-653-5p在结肠癌患者血清中的相对表达水平预测结肠癌曲线下面积（AUC）为0.823（95%CI：0.753～0.880，P＜0.01），最佳阈值为0.498，诊断的敏感性为80.26%，诊断的特异性为82.89%，如图2。

图2 血清miR-653-5p对于诊断结肠癌的ROC曲线

2.4 miR-653与结肠癌患者生存预后的相关性

随访36个月，结肠癌患者3年总体生存率为34%（26/76），在miR-653-5p 高表达组的40 例患者中，15例死亡，25 例幸存，3 年生存率为62.5%；在miR-653-5p 低表达组的36 例患者中，35 例死亡，1 例幸存，3 年生存率为2.8%。采用Kaplan-Meire 生存曲线及Log-rank法进行比较分析，结果显示，miR-653-5p低表达组3 年生存率明显低于高表达组，差异具有统计学意义（χ2=61.531，P＜0.01），见图3。多因素COX回归分析显示，临床T 分期、淋巴结转移、远处转移、miR-653-5p表达均是影响结肠癌患者预后的独立危险因素（P＜0.05），如表3。

表3 多因素COX回归分析结肠癌患者生存预后

图3 miR-653-5p高、低表达结肠癌患者的预后生存曲线

3 讨 论

miRNAs 在癌症的发生发展中发挥重要作用，可通过定向调节下游靶基因而控制机体许多重要的生命活动，有促癌或抑癌功能[12]。血清miRNAs 比目前临床上肿瘤标志物更具稳定性和特异性，可成为非侵入性肿瘤标志物，也可作为人群筛查和个体监测的指标[13]。异常表达的miRNAs 在结肠癌发生发展中起到了重要作用，预防或纠正异常的miRNAs 并恢复其正常功能，可以为结肠癌的治疗提供一种新的选择[14]。

miR-653-5p 在miRNA 功能的实验研究中受到越来越多的关注，在多种癌症中发挥重要作用[15]。miR-653-5p 在前列腺癌组织和细胞系中表达明显上调，在前列腺癌中发挥促癌作用，抑制其功能可显著降低细胞增殖和侵袭性[16]。在甲状腺癌细胞系中，miR-653-5p抑制其增殖、迁移和侵袭，促进癌细胞凋亡，circNRIP1 通过作用于miR-653-5p/PBX3a 通路抑制甲状腺癌的发生和发展[17]。miR-653-5p在非小细胞肺癌的扩增和过表达中也发挥重要作用[18]。miR-653-5p在胃癌组织、血清和细胞系中表达水平均显著上调，在体内外均可促进胃癌细胞的增殖和转移[19]，在胃癌进展中起重要作用。

本研究采用实时荧光定量PCR技术检测结肠癌患者及健康对照人群血清中miR-653-5p 的表达水平，结果表明，结肠癌患者血清中miR-653-5p 相对表达量显著低于健康人群，并且健康人群相对表达水平比部分结直肠癌患者高出一倍多，说明miR-653-5p 在结肠癌患者血清中呈现低表达状态，表明miR-653-5p可能在结肠癌的发病、发展过程中发挥抑癌作用。根据患者miR-653-5p 表达的平均值将结肠癌分为低表达组和高表达组，然后进一步分析了miR-653-5p 与临床病理指标的相关性，结果显示，在临床分期T3～T4、低分化程度、有淋巴结转移、有脉管癌栓中低表达组所占比例明显高于高表达组，表明miR-653-5p低表达状态与临床T分期晚、肿瘤低分化、脉管侵犯和淋巴结转移密切有关，其在抑制结肠肿瘤细胞生长、侵袭性和增殖方面起着重要作用，miR-653-5p在生物过程中起着类似抑癌物的作用，参与调控多个基因的表达。

在临床诊断中ROC 曲线被广泛应用于评价指标，通常曲线下面积＞0.9表示诊断价值高，0.7～0.9表示诊断价值较好，0.5～0.7表示诊断价值较低[20]。本研究中ROC 曲线分析显示miR-653-5p 在血清中的相对表达量预测结肠癌AUC 为0.823，诊断的敏感性为80.26%，诊断的特异性为82.89%，具有较好的临床诊断价值。目前临床上粪便隐血及血清CEA检测常用于结肠癌的早期判断，但其灵敏度及特异度不高[21]，结肠镜的检出率虽高，但具有侵入性[22]，血清miR-653-5p有潜力成为结肠癌患者早期诊断及广泛筛查的新型生物标志物。

另外，本研究结果显示，miR-653-5p高表达组患者的术后3年生存率为62.5%，低表达组患者术后3年生存率为2.8%，高表达组患者术后生存明显优于低表达组患者，miR-653-5p低表达的患者术后生存时间较短，预后差。有淋巴结转移和临床T 分期晚的病例往往肿瘤恶性程度更高，侵袭性和转移性更强，因此，手术后的长期生存率较低[23]，同时多因素COX分析结果显示，临床T分期、淋巴结转移、远处转移和miR-653-5p 表达均是影响结肠癌患者预后生存的危险因素，miR-653-5p参与结肠癌的发生发展，其表达水平影响着患者的生存时间。

总之，结肠癌患者血清中miR-653-5p 表达水平明显低于正常人群，与结肠癌的转移、恶性程度、临床分期及预后密切相关，具有较高的临床应用价值。miR-653-5p有潜力成为结肠癌监测、靶向治疗、预后判断的新型生物标志物。