施用三环唑与二氯喹啉酸对水稻土细菌的影响

张冰，王玖程，汪冬至，冯建骋，侯文峰，周雪，高强

（吉林农业大学资源与环境学院，长春 130118）

三环唑是防治稻瘟病专用的内吸性杀菌剂，隶属于噻唑类，其杀菌机理是通过抑制孢子的萌发和附着孢的形成，阻止病菌入侵和减少稻瘟病菌孢子的产生[1]。自1987 年首次在我国河北省推广并利用三环唑防治稻瘟病开始，至今已有30多年[2]。二氯喹啉酸是一种激素型且具有高选择性的水田专用化学除草剂[3]，其作用机理在于促进ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）在幼芽组织中合成并产生乙烯和氰化物，其大量积累后会产生毒害作用，导致杂草幼苗的黄化、失绿、坏死[4-5]。二氯喹啉酸自20 世纪80 年代末开始被大面积的推广使用，距今已有30多年[6]。

目前有关三环唑的研究主要集中在不同施用剂量对稻瘟病的防治效果[7-8]以及施用后其降解、残留等污染情况与相应修复技术[9-10]，微生物方面主要聚焦于相关降解[11]和拮抗菌株[12]的富集与筛选。二氯喹啉酸的相关研究主要集中在作用效果[13]、降解机制[14]、抗性机制[15]等方面，微生物方面主要关注降解菌的分离、鉴定[16]以及通过添加外源菌剂修复受二氯喹啉酸污染的土壤等方面[17]，也有一些研究利用磷脂脂肪酸分析（PLFA）技术分析培养条件下二氯喹啉酸对土壤微生物群落结构的影响，结果显示稻田淹水情况不同，二氯喹啉酸对土壤微生物稳定性的影响不同，但均具有含有相同标致性脂肪酸（14：0、15：0、16：0和18：2n6c）[18]的优势类群，这说明施用二氯喹啉酸会产生特异的优势类群。

三环唑和二氯喹啉酸在水稻种植中被广泛使用，但有关其对稻田土壤细菌多样性以及群落结构实际变化影响的研究较少。农药对土壤微生物群落结构影响的研究主要采用室内培养，技术手段为磷脂脂肪酸技术。本文以吉林省永吉县的稻田土壤为研究对象，分别添加不同剂量（推荐施用量以及2 倍推荐施用量）的三环唑和二氯喹啉酸，利用高通量测序技术研究施用不同时间后其对土壤细菌多样性和群落结构的影响，以期为安全与合理使用三环唑与二氯喹啉酸提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地点位于吉林省吉林市永吉县一拉溪镇鞠家村（43°47'42.98″N，126°06'49.57″E），永吉县为吉林省水稻主产区，该试验区常年施用三环唑和二氯喹啉酸。试验地属于北温带半湿润大陆季风性气候，年平均日照时间约为2 600 h，日照充足，年均气温6.5 ℃，年均降水量在200~700 mm 之间。供试土壤为白浆型水稻土，基础理化性质如下：pH 5.3，有机质15.7 g·kg-1，碱解氮89.6 mg·kg-1，速效磷45.7 mg·kg-1，速效钾151.1 mg·kg-1。

1.2 试验设计

本研究采用三环唑250 g·hm-2悬浮剂，推荐施用量（低剂量）750 g·hm-2，有效成分187.5 g·hm-2，2倍推荐施用量（高剂量）1 500 g·hm-2，有效成分375 g·hm-2。50%二氯哇琳酸可湿性粉剂，推荐施用量（低剂量）450 g·hm-2，有效成分225 g·hm-2，2 倍推荐施用量（高剂量）900 g·hm-2，有效成分450 g·hm-2。试验共设5 个处理：未施用三环唑和二氯喹啉酸处理（CK）、低剂量施用三环唑处理（TL）、高剂量施用三环唑处理（TH）、低剂量施用二氯喹啉酸处理（QL）、高剂量施用二氯喹啉酸处理（QH）。农药采用手动喷洒方式施加，分别在第0、30、107 天进行土壤样本采集（其中0 d 采集样本即为CK 处理），并迅速去除土样中可见的动植物残体及石块等，土样一部分带回实验室风干，用于土壤理化性质测定，一部分用干冰保存运输，-80 ℃冰箱储存用于微生物送检。

1.3 土壤化学性质测定

土壤化学性质测定参照《土壤农化分析》[19]。通过电位法使用复合电极测定土壤pH；重铬酸钾外加热法测定土壤有机质含量；碱解扩散法测定土壤碱解氮含量；NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量；NH4OAc浸提-火焰光度法测定速效钾含量。

1.4 DNA提取、Illumina测序和数据处理

选 用OMEGA Soil DNA Kit（D5625-01，Omega Bio-Tek，Norcross，GA，美国）试剂盒，按试剂盒的标准步骤进行土壤总DNA 的提取。选用长度约为468 bp 的细菌16S rRNA 基因的高度可变的V3~V4 区测序。PCR 扩增选用细菌16S rDNA V3~V4区特异性引物338F（5'-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3'）。16S rDNA 基因的测序在Illumina NovaSeq 上完成，首先调用qiime cutadapt trim-paired 切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列，然后通过qiime dada2 de⁃noise-paired 调用dada2进行质控、去噪、拼接、去嵌合体，完成所有文库的去噪后，合并ASVs 特征序列和ASV 表格，并去除singletons ASVs，最终基于Silva 数据库（Release132）进行物种注释。

1.5 数据分析

采用Excel 2019 软件进行数据处理。基于R 语言（4.1.3）中的vegan包，计算细菌群落的Shannon 指数和Chao1 指数，并进行Kruskal-Wallis 检验和Dunn's test 检验的显著性标记（P<0.05）以及NMDS 分析；利用RColorBrewer 包进行基于Bray-Curtis 距离的ANOSIM 分析；利用ggplot2 包进行丰富-稀有物种的统计分析、绘图[20][稀有类群（ART）为在所有样本中丰度均≤0.1%的ASV，丰富类群（AAT）为在所有样本中丰度均≥1%的ASV，中间类群（MT）为在所有样本中丰度均>0.1%且<1%的ASV，条件稀有类群（CRT）为在所有样本中丰度均<1%且仅在部分样本中丰度<0.1%的ASV，条件丰富类群（CAT）为在所有样本中丰度均>0.1%且仅在部分样本中丰度>1%的ASV，条件稀有或丰富类群（CRAT）为丰度跨越从稀有（最低丰度≤0.1%）到丰富（最高丰度≥1%）的ASV]，计算ASV在各组样本中的特异性和占有率，并以阈值>0.7为条件进行特化种的判定以及绘制SPEC-OCCU图[21]。

2 结果与分析

2.1 三环唑与二氯喹啉酸对土壤细菌α多样性的影响

图1、图2 分别为三环唑与二氯喹啉酸施用不同天数后稻田土壤细菌群落Simpson 指数和Chao1 指数箱线图。30 d 时，与CK 相比，施用三环唑对Simpson和Chao1 指数的影响均表现为低剂量施用时指数下降，高剂量施用时指数提高；施用二氯喹啉酸对Simp⁃son 指数的影响与三环唑一致，而高剂量和低剂量施用均造成了Chao1 指数的下降。107 d 时，同CK 相比，三环唑只有低剂量施用降低了Chao1 指数，而高剂量下的Chao1 指数和两种剂量下的Simpson 指数均升高；二氯喹啉酸只有高剂量施用提高了Simpson 指数，而低剂量下的Simpson 指数和两种剂量下的Chao1 指数均降低。但不论是低剂量还是高剂量，与未施药（CK）相比，施用时长对Chao1 指数和Simpson指数的影响均不显著（P>0.05），说明三环唑与二氯喹啉酸的添加对稻田土壤细菌α多样性无显著影响。

图1 稻田土壤细菌群落的Simpson指数Figure 1 Simpson index of paddy soil bacterial communities

图2 稻田土壤细菌群落的Chao1指数Figure 2 Chao1 index of paddy soil bacterial communities

2.2 三环唑与二氯喹啉酸对土壤细菌β多样性的影响

通过NMDS 分析三环唑与二氯喹啉酸对稻田土壤细菌群落的影响（图3a），结果表明在施用三环唑和二氯喹啉酸后的不同时间，不同处理的稻田土壤细菌群落结构均出现了明显的聚类分离。基于Braycurtis 距离的ANOSIM 分析结果表明（图3b 至图3e），0 d 时，各稻田土壤样本之间微生物群落结构无显著差异（P>0.05）。30 d时，同CK 相比，施用三环唑和二氯喹啉酸均使稻田土壤细菌群落结构产生了显著差异，且高剂量施用引起的细菌群落结构差异大于低剂量施用；107 d时，同CK相比，三环唑和二氯喹啉酸的施用均使稻田土壤微生物群落产生了显著差异，且高剂量施用引起的差异大于低剂量。由此可知，三环唑与二氯喹啉酸的施用时长显著影响了稻田土壤细菌群落结构，且高剂量施用对细菌群落结构的影响大于低剂量施用。

图3 稻田土壤细菌群落NMDS分析及ANOSIM相似性分析Figure 3 NMDS analysis and ANOSIM similarity analysis of soil bacterial communities in paddy fields

2.3 三环唑与二氯喹啉酸施用时长对土壤细菌物种组成的影响

2.3.1 对物种组成的影响

图4 为三环唑与二氯喹啉酸施用后稻田土壤细菌群落门水平物种组成丰度图。在三环唑与二氯喹啉酸处理门水平的物种中，Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria 的总占比大于85%，为主要物种，其中Proteobacteria 菌门丰度占比最高（30%~35%）。第0 天各稻田土壤样本之间丰度前20 的门水平注释结果无显著差异；同CK 相比，施用三环唑30 d 提高了Acidobacteria 菌门的相对丰度，降低了Actinobacteria 菌门的相对丰度，并表现出高剂量施用对菌门相对丰度的提高和降低程度大于低剂量施用；施用二氯喹啉酸30 d 提高了Chloro⁃flexi、Acidobacteria 菌门的相对丰度，降低了Proteo⁃bacteria 菌门的相对丰度，且高剂量施用对菌门相对丰度的提高、降低程度大于低剂量；施用三环唑107 d提高了Chloroflexi、Acidobacteria 菌门的相对丰度，降低了Proteobacteria、Actinobacteria 菌门的相对丰度，高剂量施用的影响大于低剂量；施用二氯喹啉酸107 d 提高了Acidobacteria 菌门的相对丰度，高剂量施用影响大于低剂量，降低了Actinobacteria菌门的相对丰度，低剂量施用影响大于高剂量。在不同时间，不同处理对门水平物种组成造成了不同程度的影响，且普遍表现为高剂量施用对稻田土壤微生物群落结构的影响大于低剂量施用。

图4 稻田土壤细菌群落丰度前20的门水平物种组成丰度图Figure 4 Abundances of top20 phylum horizontal species in soil bacterial communities in paddy fields

2.3.2 对丰富和稀有类群的影响

图5 为三环唑与二氯喹啉酸施用后稻田土壤细菌群落中优势与稀有物种的丰度图。目前对土壤微生物的丰度研究较多关注于总类群和高丰度类群，而本研究关注了低丰度的稀有类群，结果表明三环唑与二氯喹啉酸施用对稀有和条件稀有类群造成了影响。整体观测趋势为：TL、TH 处理和QL、QH 处理在30 d和107 d时，稀有类群的相对丰度均降低，且高剂量施用对稀有类群相对丰度的降低程度大于低剂量施用；条件稀有类群的相对丰度增高，且低剂量施用增加程度大于高剂量。三环唑和二氯喹啉酸的施用主要影响了稀有和条件稀有类群，最终均造成了稀有类群减少，条件稀有类群增加，而没有影响中间和条件丰富类群的相对丰度，因此三环唑和二氯喹啉酸的施用更偏向于影响低丰度类群。

2.3.3 对潜在关键物种（特化种）的影响

图6 为三环唑与二氯喹啉酸施用后稻田土壤细菌群落中潜在关键物种（特化种，特定于处理的同时又在大多数生境中常见的物种）的分析图，图7 为进一步的特化种组成分析图。施用三环唑和二氯喹啉酸产生的特化种不同，施用三环唑处理产生的特化种主要隶属于16 个菌门，其中低剂量施用三环唑产生的特化种所属菌门8 个，高剂量施用产生的特化种所属菌门13 个，共有菌门5 个，低剂量施用产生的特化种所分布的特有菌门为Actinobacteria、Cyanobacteria和Firmicutes 菌门，高剂量施用产生的特化种所分布的特有菌门为Elusimicrobia、Fibrobacteres、Kiritimati⁃ellaeota、Latescibacteria、Nitrospirae、Verrucomicrobiav、WOR-1 和WPS-2 菌门，高剂量施用三环唑产生的特化种所分布的菌门种类多，说明在三环唑的施用中高剂量施用对特化种的影响更大。施用二氯喹啉酸处理产生的特化种主要隶属于12 个菌门，其中低剂量和高剂量施用二氯喹啉酸产生的特化种所属菌门均为11个，共有菌门10个，低剂量施用产生的特化种所分布的特有菌门为Zixibacteria，高剂量施用产生的特化种所分布的特有菌门为Cyanobacteria，说明高剂量施用和低剂量施用二氯喹啉酸产生的特化种虽分布的门数相同，但实际分布的菌门并不相同。本研究最终发现：不同处理对共有的特化种菌门丰度均造成了影响，普遍规律为高剂量施用的影响大于低剂量施用；施用三环唑产生更多的特化种，其所分布的特有菌门（7 种）高剂量施用6 种，低剂量施用1 种，而二氯喹啉酸施用只在低剂量下具有1个特有菌门。

图6 稻田土壤细菌群落潜在关键物种（特化种）分析Figure 6 Analysis of potential keystone species（specialized species）of paddy soil bacterial communities

图7 稻田土壤细菌群落潜在关键物种（特化种）组成分析Figure 7 Analysis of the composition of potential keystone species（specialized species）in paddy soil bacterial communities

3 讨论

近年来，三环唑和二氯喹啉酸的广泛施用在一定程度上改变了稻田土壤微生物群落结构[22]，本研究通过田间试验发现，不论高剂量还是低剂量施用三环唑和二氯喹啉酸均不影响土壤α 多样性指数。García-Jaramillo 等[23]研究三环唑对土壤微生物群落的影响发现，随着水稻生长，三环唑不会影响细菌和真菌群落的多样性，这与本文研究结果一致，分析原因可能是三环唑与二氯喹啉酸的施用对微生物群落的影响特异性低，专一性较高。谢泰祥等[24]的研究结果表明微生物的定殖与变化具有不同的喜爱偏好，其主要受外界不同因素的影响，可归因于微生物的生态专一性和多样性。但不同剂量三环唑和二氯喹啉酸与CK处理相比均显著影响了稻田土壤细菌群落结构，在施用不同时间后，时间不同处理的稻田土壤细菌群落结构均随着时间的演替，出现了明显的聚类分离。30 d和107 d 时，三环唑和二氯喹啉酸处理均是高剂量施用的影响大于低剂量施用，这与张妤[25]、杨彩宏等[26]利用磷脂脂肪酸法研究二氯喹啉酸对土壤微生物群落结构的影响结论一致。因此，高剂量施用三环唑和二氯喹啉酸对稻田土壤微生物群落结构的影响比低剂量施用更大。

在物种水平上进行分析发现，三环唑和二氯喹啉酸处理丰度前20 的门水平物种同样受高剂量影响大于低剂量，其中优势菌门为Proteobacteria 菌门[17]。其他研究也表明施用农药后Proteobacteria 为优势菌门[27]。将不同丰度的ASV 划分为丰富和稀有类群，发现三环唑和二氯喹啉酸的施用均造成稀有类群的减少，条件稀有类群的增加，中间类群和条件丰富类群并未受到影响。李涛等[28]在乙草胺对农田土壤动物群落结构的影响研究中得出乙草胺施用主要是对常见类群和稀有类群的影响，这与本文研究结果趋同，均表明农药的添加与施用更偏向于对稀有类群的影响。Pedrós-Alió 等[29]发现丰富的物种生长速度快，适应性好，而稀有物种生长速度慢，对外界条件更为挑剔。因此，土壤稀有微生物可能对环境变化更为敏感。本文通过计算物种的特异性和占有率来寻找可归属于不同处理的潜在关键物种（特化种），并分析在施用三环唑和二氯喹啉酸条件下，共有特化种的相关丰度变化以及特异性差异组成，研究结果表明，特化种中共有的Acidobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimon⁃adetes、Chloroflexi、Proteobacteria 5 个菌门的相对丰度均受到不同程度的影响，且高剂量施用对菌门相对丰度的影响大于低剂量施用，高剂量与低剂量施用对微生物的稳定性及丰度均造成不同程度的影响[30]。同时在对特化种组成进一步分析中发现，施用三环唑处理产生的特异性物种及其分布的菌门远多于施用二氯喹啉酸处理，且高剂量施用的影响大于低剂量施用。目前对农药处理下特化种的研究较少，大多研究主要集中于施用农药与除草剂后土壤微生物群落结构[31]和物种组成的变化情况[32]。

4 结论

通过田间试验发现，三环唑和二氯喹啉酸的施用对稻田土壤细菌α多样性无显著影响，但显著影响了细菌群落结构，且高剂量施用的影响大于低剂量施用，最终导致稀有类群的减少，条件稀有类群的增加。下一步可针对三环唑和二氯喹啉酸施用导致的土壤微生物整体群落功能及特化种功能的变化进行深入研究。