基于网络药理学和分子对接技术探讨贞芪扶正颗粒辅助治疗肺结核的作用机制

黄 正 赵瑞强 李 平

(1 天长市人民医院感染科,安徽省天长市 239321;2 广西医科大学基础医学院,广西南宁市 530021)

肺结核是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染性疾病,以咳嗽、咯血、潮热、盗汗及消瘦为主要临床特征。现代中医学认为该病多由正气不足,感染痨虫,侵蚀肺脏而引起,治疗当以补虚培元和抗结核杀虫为原则,根据患者体质强弱区分治疗主次,尤其需要重视补虚培元、增强正气,以提高患者的抗病能力[1]。一项荟萃分析结果表明,中西医联合治疗肺结核可减少西药毒副作用,提高患者机体免疫力,改善患者临床症状[2]。贞芪扶正颗粒的主要有效成分为女贞子、黄芪,具有健脾益气、滋阴补肾、扶正固本的功效,常用于虚损的治疗及化疗的辅助治疗等。临床研究表明,贞芪扶正颗粒辅助治疗肺结核可以提高临床疗效[3],然而其作用机制尚未完全明确。网络药理学能从系统生物学和生物网络平衡的角度阐释疾病的发生、发展过程,还能从改善或恢复生物网络平衡的角度分析药物与机体的相互作用并指导新药研发,目前已被广泛应用于中药研究。因此,本研究运用网络药理学及分子对接技术,探讨贞芪扶正颗粒辅助治疗肺结核的作用机制,以期为肺结核的临床治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 贞芪扶正颗粒的活性化学成分及其作用靶点的筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索贞芪扶正颗粒中女贞子、黄芪两味中药的所有化学成分,设置口服生物利用度(oral bioavailability,OB)>30%、药物相似性(drug likeness,DL)>0.18以初步筛选活性化学成分,然后在该平台上检索活性化学成分的作用靶点,获得贞芪扶正颗粒的活性化学成分及其作用靶点[4]。在UniProt数据库(http://www.uniprot.org)中,将限定物种设置为人类,对靶点进行标准基因名转化。

1.2 肺结核相关靶点的获取 以“tuberculosis”为检索词,在GeneCards®数据库(http://www.genecards.org)中检索肺结核相关靶点[5],检索日期为建库至2021年9月。

1.3 贞芪扶正颗粒治疗肺结核相关靶点的获取及其蛋白-蛋白相互作用网络的建立 将贞芪扶正颗粒活性化学成分的作用靶点与肺结核相关靶点上传至VENNY 2.1平台(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),获取交集靶点,即贞芪扶正颗粒治疗肺结核的相关靶点。将交集靶点及其对应的贞芪扶正颗粒活性化学成分导入Cytoscape 3.7.2软件,构建贞芪扶正颗粒治疗肺结核的“中药-成分-靶点”网络,利用Centiscape插件进行拓扑学分析,获取度值,将度值排名前5的活性化学成分作为主要活性化学成分。将交集靶点导入STRING数据库(https://string-db.org),获取其蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)数据[6],然后将数据导入Cytoscape 3.7.2软件,生成PPI网络,利用Centiscape插件进行拓扑学分析,获取度值、中介值、特征向量值,选取度值排名前10的靶点作为核心靶点。

1.4 贞芪扶正颗粒治疗肺结核相关靶点的富集分析 分别利用WebGestalt平台(http://www.webgestalt.org/)和KOBAS平台(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)对核心靶点进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,GO功能富集分析项目包括生物过程、分子功能、细胞组分。按基因比率由大到小进行排序,选取排名前10的条目进行展示。

1.5 分子对接分析 将贞芪扶正颗粒治疗肺结核的“中药-成分-靶点”网络中度值排名前5的主要活性化学成分作为配体蛋白,从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载其2D结构。将PPI网络中的核心靶点作为受体蛋白,从蛋白质结构数据库(https://www.rcsb.org/)下载其3D结构[7]。利用Chimera 1.15软件对受体蛋白进行去水、加氢、去除配体等处理,并寻找其对接口袋。运用AutoDock软件对受体蛋白及配体蛋白进行分子对接,获取结合能。结合能越小说明结合活性越大,其中结合能<-5 kcal/mol表示结合活性良好,<-7 kcal/mol表示具有结合活性明显增强。

2 结 果

2.1 贞芪扶正颗粒的活性化学成分及作用靶点 通过检索获得黄芪的化学成分118个,筛选后得到活性化学成分20个及对应作用靶点180个;获得女贞子的化学成分119个,筛选后得到活性化学成分13个及对应作用靶点177个。删除重复项后,共得到贞芪扶正颗粒的化学成分201个,其中活性化学成分31个及对应作用靶点198个。

2.2 贞芪扶正颗粒治疗肺结核的相关靶点 共获得2 415个肺结核相关靶点。将贞芪扶正颗粒活性化学成分的作用靶点与肺结核相关靶点取交集后,得到101个交集靶点。利用交集靶点及其对应的活性化学成分构建贞芪扶正颗粒治疗肺结核的“中药-成分-靶点”网络,该网络有125个节点及273条边,见图1。度值排名前5的活性化学成分依次是槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素。

图1 贞芪扶正颗粒治疗肺结核的 “中药-成分-靶点”网络图

2.3 贞芪扶正颗粒治疗肺结核相关靶点的PPI网络 将101个交集靶点导入STRING数据库,并利用Cytoscape 3.8.0软件构建PPI网络(见图2),该网络包含100个节点和3 448条边,平均度值为34.48。根据拓扑学分析结果,选取度值排名前10的靶点作为核心靶点,包括白细胞介素(interleukin,IL)-6、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1,AKT1)、IL-1β、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9、Caspase-3、原癌基因c-Jun(proto-oncogene c-Jun,JUN)、C-X-C基序趋化因子配体8(C-X-C motif chemokine ligand 8,CXCL8)、前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、过氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor gamma,PPARG),见表1。

表1 核心靶点的拓扑学参数

图2 贞芪扶正颗粒治疗肺结核相关靶点的PPI网络图

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析结果 GO功能富集分析共得到3 040个生物过程条目、143个细胞组分条目、270个分子功能条目,KEGG通路富集分析共得到178条通路。按基因比率由大到小进行排序,选取排名前10的条目进行展示。生物过程条目包括机械刺激反应、生物调节、代谢过程等,细胞组分条目包括细胞膜、细胞核、膜封闭管腔等,分子功能条目包括蛋白质结合、核苷酸结合、离子结合等,见图3。KEGG信号通路包括IL-17信号通路、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、利什曼病、Th17分化通路等,见图4。

图3 GO功能富集分析气泡图

图4 KEGG信号通路富集分析炫图

2.5 分子对接分析结果 将“中药-成分-靶点”网络中的主要活性化学成分与PPI网络中的核心靶点进行分子对接,两者的结合能见图5。其中,槲皮素与MMP9的结合活性最大(结合能=-9.7 kcal/mol),与MMP9的活性位点MET-247、LEU-188、ALA-189形成氢键,见图6。

图5 分子对接的结合能色阶图

图6 槲皮素与MMP9的分子对接结合图

3 讨 论

目前异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等抗结核药物仍是结核病的一线治疗药物,其虽然能发挥良好的药效,但长期使用容易导致患者产生耐药性及发生肝损伤等不良反应。国内一项针对364例初治涂阳肺结核患者的队列研究表明,相比单纯化疗,采用化疗方案联合贞芪扶正颗粒治疗的患者,痰菌转阴率、结核菌素试验转阴率、CD4+T淋巴细胞/CD8+T淋巴细胞值升高率均更高,提示贞芪扶正颗粒可提高患者的细胞免疫功能,促进T淋巴细胞转化、增殖并产生特异性淋巴因子,从而增强T淋巴细胞的吞噬、消化功能,以达到杀灭结核分枝杆菌的目的[8]。贞芪扶正颗粒的主要有效成分为女贞子、黄芪。黄芪味甘,性微温,归脾、肺二经,具有补气固表、托毒排脓、利尿、生肌的作用,有利于促进肺结核患者痰菌转阴、病灶吸收和空洞愈合[9]。女贞子性平,味甘、苦,归肝、肾二经,可配伍其他药物,具有滋阴益寿、补益肝肾、清热明目、乌须黑发等功效,对化学性肝损伤有显著改善作用[10]。

本研究结果显示,贞芪扶正颗粒的主要活性化学成分包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素。槲皮素作为一种广泛存在于自然界的天然黄酮类化合物,具有抗氧化、抗病毒、抗炎等多重生物活性。有学者发现,在肺结核小鼠模型中,槲皮素通过抑制Toll样受体4介导的炎症相关信号通路,减少炎症因子IL-1β的分泌,从而起到免疫调节作用,减轻肺组织病理损伤[11-12]。研究表明,槲皮素通过抑制脂肪酸和霉菌酸生物合成的关键酶,对结核分枝杆菌发挥杀灭及抑制活性的作用[13]。木犀草素多以糖苷的形式存在于多种植物,具有止咳、化痰、消炎、降尿酸的作用。研究表明,木犀草素可以抑制巨噬细胞极化、核转录因子κB活性,以及脂多糖诱导的巨噬细胞释放细胞因子IL-6、TNF-α[14]。此外,木犀草素还具有抑制尿酸生成和促进尿酸排泄的作用,能有效改善吡嗪酰胺所致的继发性高尿酸血症[15]。CYP121是细胞色素酶P450家族的成员之一,是结核分枝杆菌存活所必需的酶,参与结核分枝杆菌类固醇、脂肪酸和异生物质的氧化过程,可以作为结核的治疗靶点[16],而研究表明山柰酚及其苄基衍生物是良好的CYP121抑制剂[17]。临床研究表明,结核分枝杆菌感染可导致结构性肺病,易引发铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌等病原菌合并感染[18]。β-谷甾醇作为天然甾体类物质,具有抵抗细菌入侵、抗氧化、抗炎的作用,可降低巨噬细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3炎性小体的表达水平,抑制丝裂原活化蛋白激酶信号通路的活化,使IL-6、TNF-α、IL-8表达水平降低,从而起到抗炎作用[19-20]。结核患者在化疗过程中常出现药物性肝炎,而芒柄花素可以通过下调TNF-α、核转录因子κB-p65、Toll样受体3的mRNA表达水平,减轻化疗药物的肝毒性,从而改善患者肝功能[21]。另外,肺结核患者通常同时合并2型糖尿病,芒柄花素能有效控制体重、高血糖,改善胰岛素抵抗、瘦素水平,减轻全身炎症反应,从而起到缓解肺结核患者病情的作用[22]。

本研究的分子对接分析结果表明,MMP9、IL-6、PTGS2、PPARG、CXCL8均与贞芪扶正颗粒的主要活性化学成分有稳定的对接效果(结合能<-5.0 kcal/mol)。MMP9属于MMP家族成员,参与细胞外基质的分解。大部分肺结核患者存在肺纤维化,其原因为MMP9表达不足导致机体对细胞外基质的分解作用减弱,使得细胞外基质堆积进而形成肺纤维化[23]。黄芪可提高肺结核患者血浆及肺泡灌洗液中的MMP9浓度,逆转肺纤维化[9]。巨噬细胞是结核分枝杆菌感染的主要人类宿主细胞,肺巨噬细胞在吞噬结核分枝杆菌过程中分泌的炎症因子增多,导致肺组织损伤。例如,临床中常可见肺结核活动期患者体内IL-6水平增高,而黄芪可降低患者血浆IL-6水平,从而延缓肺结核进展[9]。在感染结核分枝杆菌的巨噬细胞中,PTGS2的表达水平显著增加[24],而黄芪可降低大鼠肺泡巨噬细胞中PTGS2的表达水平,从而起到抗纤维化作用[25]。目前已有研究表明,结核分枝杆菌能够诱导宿主细胞PPARG表达上调,敲除肺巨噬细胞的PPARG基因可以抑制结核分枝杆菌的增殖,表明抑制PPARG活性有利于机体杀灭结核分枝杆菌[26]。CXCL8是负责招募CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的主要趋化因子,可增强结核患者的先天性免疫反应及巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌的能力,并可作为诊断肺结核和评估肺结核病情的生物标志物之一[27-28]。

GO功能富集分析结果表明,核心靶点主要分布于细胞膜、细胞核、膜封闭管腔等细胞组分,通过发挥蛋白质结合、核苷酸结合、离子结合等分子功能,进而在机械刺激反应、生物调节、代谢过程等生物学过程中发挥关键作用。KEGG通路富集分析表明,核心靶点主要集中在IL-7信号通路及TNF信号通路,PTGS2、JUN、Caspase-3为这两条通路的共有基因。PTGS2基因编码前列腺素生物合成中的关键酶环氧化酶2,其是一种双功能酶,具有环氧化酶和过氧化氢酶活性,是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶,参与炎症反应和前列腺素的生物合成[29]。JUN作为核因子E2相关因子2和小Maf蛋白K的辅助因子,在调控抗氧化反应元件和活性氧簇的产生中起着关键作用[30]。Caspase-3基因编码的蛋白是一种Caspase,在细胞凋亡的执行阶段起着核心作用。IL-17信号通路在保护宿主免受细胞外病原体侵害方面具有重要作用[31],CD4+T淋巴细胞、单核细胞、γδ T淋巴细胞分泌的IL-17通过招募中性粒细胞来参与清除结核分枝杆菌的过程,但同时也可能加重局部炎症反应,导致肺损伤[32]。TNF-α参与巨噬细胞抵抗结核分枝杆菌感染和结核性肉芽肿形成的过程,还能诱导巨噬细胞凋亡和其他细胞因子的释放,在抗感染方面具有一定的积极作用,但过度激活可导致急性呼吸窘迫综合征,使病情恶化[33]。研究显示,肺结核患者体内存在明显的免疫功能紊乱,抗结核治疗后患者血清TNF-α、IL-17水平明显降低,说明在肺结核活动期炎症相关信号通路处于激活状态[34]。贞芪扶正颗粒可能通过抑制炎症相关信号通路的过度激活,稳定机体免疫功能,从而发挥辅助治疗肺结核的作用。

综上所述,贞芪扶正颗粒辅助治疗肺结核的机制具有多成分、多靶点和多通路的特点,其活性化学成分槲皮素、木犀草素等可能通过作用于MMP9、IL-6、PTGS2、PPARG、CXCL8等靶点,来抑制IL-7信号通路、TNF信号通路,从而发挥辅助治疗肺结核的作用。