3种食用菌抗氧化抗发炎的对比研究

邓艺恒，黄永铭，冯亚栋，张书迪，王贵弘，庞海月*

1. 厦门医学院，天然化妆品福建省高校工程研究中心（厦门 361023）；2. 厦门医学院，公共卫生与医学技术系（厦门361023）；3. 福建农林大学生命科学学院，生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建省病原真菌与真菌毒素重点实验室（福州 350002）

福建省是银耳、猴头菇、秀珍菇3种食用菌的生产基地，具有地方特色和普及性。银耳主要活性成分为银耳多糖（Tremellam），其具有护肝解毒、养颜护肤等功能[1-2]。银耳多糖通过提高血清、肝脏和心脏部位GSH-Px、SOD活性并降低MDA浓度（P＜0.01），显著提高机体抗氧化能力[1,3]，且随着浓度的增加，其抗氧化能力随之增强[5]。服用银耳多糖对炎症与抗炎系统的激活均有一定抑制作用[4]。猴头菇是药食两用真菌，具有抗衰老、抗癌等功效，常用于治疗慢性胃炎、十二指肠与胃溃疡等疾病[6]。猴头菇含有70多种次生代谢物，主要包括猴头多糖、猴头菌素、猴头菇酮等[7]。猴头多糖可提高小鼠肝脏和脑中SOD的活力[8]。猴头菇酮、猴头菌素及猴头多糖具有抗炎作用[9]。秀珍菇，作为一种极具营养价值的珍稀食用菌，具有滋补身体、安神除烦等生理功能，有着“菇中极品”的美誉[10-12]。吕建敏等[13]在秀珍菇粉对H22荷瘤小鼠体内抗肿瘤作用研究中证明其具有较好的抑肿瘤作用。其子实体还包含抗氧化性较强的硒元素[14]。其内的多糖物质可降低IL-6、TNF-α、NF-B的含量及活性，表明其能够通过抑制炎症因子的数量和活性发挥抗炎的作用[15]。此次试验旨在研究三者的生理活性，进而将其开发为保健品、食品、功效性化妆品，开拓更广阔的经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

JY92-IIN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）；V-100旋转蒸发仪（BUCHI Labortechnik AG）；SpectraMax i3x多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；FDU-1200冷冻干燥机（上海爱朗仪器有限公司）。

银耳、猴头菇、秀珍菇（福建省古田县）；马铃薯葡萄糖水、酵母粉、麦芽提取粉（广东环凯微生物科技有限公司）；琼脂、硫酸镁、二甲亚砜（国药集团化学试剂有限公司）；无水磷酸二氢钾、维生素C（VC）、左旋多巴[均为生工生物工程（上海）股份有限公司]；葡萄糖、过硫酸铵、乙二胺四乙酸二钠、甲醇（均为西陇科学股份有限公司）；一氧化氮检测试剂盒、活性氧检测试剂盒（均为上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM高糖细胞培养液（兰杰柯科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 3种可食用菌提取物的制备

1.2.1.1 3种可食用菌子实体提取

将银耳、秀珍菇、猴头菇的子实体剪碎，称重，分别用95%乙醇和水进行超声破碎。超声破碎条件：破碎30 s、暂停30 s，功率90%，破碎总时长2 h。将破碎后的液体进行旋蒸浓缩，浓缩液经过冷冻干燥获得子实体提取物，分别命名为水提银耳（WET）、水提猴头菇（WEH）、水提秀珍菇（WEP）、醇提银耳（EET）、醇提猴头菇（EEH）、醇提秀珍菇（EEP）。

1.2.1.2 3种可食用菌菌丝体提取

将银耳、秀珍菇、猴头菇分别接种于改良的马铃薯葡萄糖固体培养基中，放置于25 ℃的恒温培养箱内培养，待其长满后，接种至液体发酵培养基中，放置25 ℃恒温振荡培养箱内振荡培养1周，经纱布过滤将菌丝体与菌液分离，菌丝体称重，分别用95%乙醇和水进行超声破碎。超声破碎条件：破碎30 s、暂停30 s、功率90%，破碎总时长2 h。将破碎后的液体进行旋蒸浓缩，浓缩液经过冷冻干燥获得菌丝体提取物，分别命名为水提银耳（WET）、水提猴头菇（WEH）、水提秀珍菇（WEP）、醇提银耳（EET）、醇提猴头菇（EEH）、醇提秀珍菇（EEP）。

1.2.2 ABTS自由基清除能力的测定

ABTS自由基清除能力试验方法参照张启贵等[16]的方法进行。取一定量ABTS加入适量蒸馏水中，将其配成7 mmol/L ABTS溶液。另取一定量过硫酸钾加入蒸馏水，配成140 mmol/L过硫酸钾溶液。

将440 μL 140 mmol/L过硫酸钾溶液与25 mL 7 mmol/L ABTS溶液混合，避光反应12～16 h，用乙醇稀释ABTS溶液至吸光度0.700±0.002。将样品分别稀释成不同的质量浓度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），以维生素C作为阳性对照，取0.9 mL ABTS溶液与0.1 mL样品混合，测定734 nm波长下的吸光度。ABTS自由基清除率（%）按式（1）计算。

式中：A0为空白对照组吸光度；A1为样品试验组吸光度。

1.2.3 金属螯合能力的测定

金属螯合能力参照欧阳吾乐等[17]的方法进行。将样品分别稀释成不同的质量浓度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），阳性对照采用乙二胺四乙酸二钠，依次加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪、0.05 mL 2 mmol/L四水氯化亚铁和1.8 mL甲醇，混合后避光反应10 min，测定562 nm波长下的吸光度。金属螯合能力相对清除率（%）按式（2）计算。

式中：A0为空白对照组吸光度；A1为样品试验组吸光度。

1.2.4 NO清除能力测定

将样品分别稀释成不同的质量浓度（1.00，0.50，0.10和0.02 mg/mL），阳性对照采用维生素C。在EP管中依次加入120 μL样品、120 μL亚硝酸钠（0.02 μmol/L）、120 μL Griess Reagent1和120 μL Griess Reagent2，振荡混合，避光反应10 min后在540 nm波长处测定吸光度。NO相对清除率（%）按式（3）计算。

式中：A0为空白对照组吸光度；A1为样品试验组吸光度。

1.2.5 细胞活性氧检测

用含10%胎牛血清的培养液配成RAW264.7细胞悬液，接种到黑色96孔板，每孔体积100 μL，培养12 h。待细胞数量长到孔的80%左右时，每孔加入5 μL的样品和87 μL含10%胎牛血清的培养液，培养24 h，加入400 μmol/L氧化氢作用4 h。

活性氧检测试剂盒中的DCFH-DA按照1∶1 000的比例用无血清的细胞培养液稀释初始DCFH-DA，使其终浓度为10 mol/L，将上述96孔板的培养液吸光，每孔加入100 μL稀释后的DCFH-DA，在37 ℃ 5%二氧化碳培养箱中孵育20 min，用PBS缓冲液稀释3次，在488 nm激发波长和525 nm发射波长下检测其荧光强度。

1.2.6 细胞水平NO清除能力测定

用含10%胎牛血清的培养液配成RAW264.7细胞悬液，接种到96孔板，每孔体积100 μL，培养24 h。待细胞数量长到孔的80%左右时，每孔加入5 μL的样品和93 μL的含10%胎牛血清的培养液，培养2 h，每孔加入2 μL的LPS（1 μg/mL），继续培养24 h，每孔取50 μL上清液，加50 μL Griess Reagent1和50 μL Griess Reagent2，测定540 nm波长下的吸光度。细胞水平NO相对清除率（%）按式（4）计算。

式中：A0为空白对照组吸光度；A1为样品试验组吸光度。

1.3 数据处理与分析

每份样品都进行3次的平行测定，测定结果取3次平行测定的平均值，用GraphPad Prism对结果进行作图分析。试验数据以“平均值±标准差”表示，采用GraphPad Prism对结果进行作图分析。组间两两比较采用最小显著差异，用字母a、b、c、d表示其差异性，若字母相同则代表二者没有显著性差异，若字母不同则代表二者具有显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 ABTS自由基清除能力的测定

通过图1（a）对水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物对ABTS自由基清除能力进行分析，可以看出随着可食用菌子实体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物对ABTS自由基清除能力也降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的清除ABTS能力最强；醇提物中，醇提秀珍菇清除ABTS的能力大于醇提猴头菇大于醇提银耳。

图1 不同浓度子实体（a）和菌丝体（b）提取物对ABTS阳离子自由基的清除率

通过图1（b）对水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物对ABTS自由基清除能力进行分析，可以看出随着可食用菌子实体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物对ABTS自由基清除能力也降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的清除ABTS能力最强，水提银耳与水提猴头菇次之；醇提物中，3种可食用菌的清除ABTS能力相当。这与商佳琦等[18]在分析5种食用真菌中银耳以及猴头菇抗氧化性的试验结果基本吻合。

2.2 金属螯合能力的测定

通过图2（b）对水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物的金属螯合能力进行分析，可以看出随着可食用菌子实体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物的金属螯合能力也随之降低，其中：水提物中，水提猴头菇的金属螯合能力最强，水提秀珍菇次之，水提银耳最弱；醇提物中，3种可食用菌的金属螯合能力不分伯仲。

图2 不同浓度子实体（a）和菌丝体（b）提取物金属螯合能力相对清除率

通过图2（a）对水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物的金属螯合能力进行分析，可以看出随着可食用菌菌丝体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物的金属螯合能力也随之降低，其中：水提物中，水提秀珍菇的金属螯合能力最强，水提银耳次之，水提猴头菇最弱；醇提物中，醇提银耳的金属螯合能力最强，醇提猴头菇次之，醇提秀珍菇最弱。

2.3 生化水平NO清除能力测定

通过图3（a）对水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物生化水平清除NO能力进行分析，可以看出随着可食用菌子实体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物生化水平清除NO能力也随之降低，只有水提银耳有清除NO的能力。

图3 不同浓度子实体（a）和菌丝体（b）提取物生化水平NO相对清除率

通过图3（b）对水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物生化水平清除NO能力进行分析，可以看出随着可食用菌子实体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物生化水平清除NO能力也随之降低，其中：水提物生化水平清除NO能力弱；醇提物生化水平清除NO能力比水提物强，且3种可食用菌菌丝体醇提取物生化水平清除NO能力不相上下。这与Zhang等[19]对于药用真菌抗发炎能力的研究有着异曲同工之妙。

2.4 细胞活性氧检测

通过图4（a）对水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物作用细胞后，从其活性氧荧光强度分析可以看出，随着可食用菌子实体提取物浓度的升高，荧光强度随之降低，细胞内的活性氧也随之降低。

图4 不同浓度子实体（a）和菌丝体（b）提取物作用细胞的活性氧荧光强度

通过图4（b）对水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物作用细胞后，从其活性氧荧光强度分析可以看出，随着可食用菌菌丝体提取物浓度的升高，荧光强度总体上呈也随之降低，表明此3种食用菌的菌丝体提取物对活性氧有一定的清除效果。

2.5 细胞水平NO清除能力测定

通过图5（a）对水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物细胞水平清除NO能力进行分析，可以看出随着可食用菌子实体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物细胞水平清除NO能力总体上呈下降趋势，水提和醇提的3种可食用菌子实体提取物细胞水平清除NO能力都较弱。

图5 不同浓度菌丝体（a）和子实体（b）提取物细胞水平NO相对清除率

通过图5（b）对水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物细胞水平清除NO能力进行分析，可以看出随着可食用菌菌丝体提取物浓度的降低，水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物细胞水平清除NO能力也随之降低，水提和醇提的3种可食用菌菌丝体提取物都具有一定的细胞水平清除NO能力，且醇提物的效果要优于水提物的效果。

3 结论

提取3种均来自福建省古田县的食用真菌，通过ABTS自由基清除试验、金属螯合能力测定试验及细胞活性氧测定试验，较全面地反映了水提或醇提的3种可食用菌子实体与菌丝体的抗氧化能力，无论是水提物还是醇提物，结果都表明秀珍菇的抗氧化能力最强。通过生化水平NO抑制试验及细胞水平NO抑制试验证明水提或醇提的3种可食用菌菌丝体与子实体的抗炎能力，结果表明水提与醇提的3种可食用菌子实体与菌丝体都具有一定抗炎效果，除了银耳以外，其余2种可食用菌子实体与菌丝体的醇提物抗炎能力大于水提物。陈云波等[20]将银耳多糖应用于化妆品的一系列工艺已经较为完备。由此可见这3种食用真菌特别是秀珍菇可作为潜在的天然抗氧化剂应用于药品和食品工业中。若能进一步提纯，这3种食用真菌提取物也可应用于抗炎的药品和高端化妆品中。这些都为古田县农产品的产业升级提供理论基础。