强骨抗萎膏通过调控MFN2及抑制内质网应激改善失重状态下大鼠骨丢失

史长华，田雷瑜，冯 婧，李姝玉，刘军莲，刘雨梦，刘嘉鹏，王 谦*

（1.北京中医药大学，北京 100029； 2.中国航天员科研训练中心，北京 100094）

太空飞行中的失重引起的骨质疏松，是损害宇航员健康的重要危险因素。失重导致肌肉、骨骼系统结构和功能变化，主要表现为骨质疏松、骨架脱钙和骨性退化等[1]。中医药在抑制骨质流失方面历史悠久，被广泛应用于航天医学的研究领域。课题组前期研究发现，强骨抗萎膏可改善失重状态下骨的生物力学特性，促进骨矿盐的沉积，增强骨密度，减少骨质丢失，并能增强骨的代谢功能[2-4]。

内质网是蛋白质合成与翻译后修饰，多肽链正确折叠与装配的重要场所。在应激原刺激下，细胞会发生内质网应激（endoplasmic reticulu mstress，ERS）。当细胞内发生错误折叠蛋白累积、自噬不足、钙超载、氧化应激、炎症和缺氧时，ERS被激活[5]。适应性ERS可以触发未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）纠正错误折叠蛋白并促进蛋白清除能力[5-6]，UPR通过三个主要分支传递信号：蛋白激酶R样内质网激酶（PERK），肌醇依赖性激酶 1（IRE1）和活化转录因子 6（ATF6）途径。ERS发生时，内质网分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（GRP78）亲和力下降，与PERK、IRE1和ATF6分离，然后激活下游信号分子，如C/EBP同源蛋白（CHOP）[7]。线粒体是细胞产生能量的主要场所。线粒体融合蛋白MFN2在调控线粒体运动和细胞凋亡中发挥重要作用[6，8]。MFN2出现在内质网与线粒体结合部位，越来越多的证据表明，内质网和线粒体之间的特定互动和合作是细胞功能所必需的[8]。研究发现，在微重力或力学负荷作用下，细胞功能的变化伴随着内质网应激和线粒体分裂融合的运动状态而改变[9]，造成细胞凋亡，其发生机理尚未阐明。

本研究在前期研究基础上，着重观察强骨抗萎膏对模拟失重的尾吊大鼠骨细胞凋亡，内质网应激相关蛋白 GRP78，PERK、IRE1α、ATF6和 MFN2 表达的作用，阐释强骨抗萎膏对失重致骨丢失的影响及其可能的分子机制，为中药临床防治失重后骨丢失提供实验依据。

1 实验动物及试剂

1.1 实验动物 实验采用的SPF级雄性SD大鼠购自中国食品药品检定研究院 [许可证号：SCXK（京）2017-0005]。按照实验动物使用的3R原则给予关怀。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 实验药物和试剂 强骨抗萎膏由航天员科研训练中心提供，由熟地、骨碎补、龟板、怀牛膝等按比例组成（生成批号：2171101）。阿仑膦酸钠（石药集团欧意药业有限公司，批准文号H20061303）。骨疏康颗粒（辽宁康辰药业有限公司，批准文号Z20060270）。BCA蛋白测定试剂盒、蛋白Marker与ECL发光试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；GRP78和CHOP单克隆抗体购自Abcam公司，兔抗大鼠PERK、IRE1α、ATF6和MFN2多克隆抗体购自Cell Signaling公司；大鼠单克隆抗体GAPDH和HRP标记的羊抗兔IgG购自美国proteintech公司；HiFiScript gDNA Removal TM RT Master Mix试剂盒及UltraSYBR Mixture购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司。

1.2.2 仪器和设备 SynergyⅡ型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；荧光定量 PCR 仪（CFX96）、Bio-Rad垂直电泳系统、Bio-Rad湿法电转印系统（伯乐生命医学产品有限公司）。

2 方法

2.1 动物分组 实验动物分为对照组、模拟失重组、强骨抗萎膏组、阿仑膦酸钠组，骨疏康颗粒组；大鼠体质量400 g左右，每组12只。模拟失重组：按照Morey-Holton的尾部悬吊28天模拟失重[10]。后肢悬垂与头部约成30°夹角，大鼠可做旋转活动和自由饮食，光照黑暗时间各12 h。对照组和模拟失重组为正常饮食和光照，每日灌服生理盐水。其它3组按上述方法复制模型，同时分别每日给予强骨抗萎膏2.4 g/kg；阿仑膦酸钠0.007 g/kg和骨疏康颗粒0.26 g/kg。

2.2 TUNEL染色检测凋亡 大鼠脱颈处死后，快速分离出完整的股骨组织，取部分骨于4%多聚甲醛溶液中固定，脱钙，脱水，石蜡包埋切片，并进行TUNEL染色，苏木素复染，脱水封片。在光学显微镜下（×20）观察骨细胞凋亡情况。核棕色为阳性，蓝色为阴性，使用Image J软件进行统计。

2.3 RT-PCR检测大鼠骨组织中 PERK、CHOP、IRE1α及ATF6 mRNA的表达水平 分别提取各组大鼠骨组织总RNA，逆转录成cDNA作为RT-PCR的模板。由上海生工设计并合成 PERK、CHOP、IRE1α、及ATF6的引物序列（表1），以GAPDH 作为内参照，通过2－ΔΔCt法比较各组大鼠骨组织mRNA的相对含量。

2.4 Western blot检测大鼠骨组织中GRP78、PERK、IRE1α、ATF6、CHOP及MFN2蛋白的表达水平 提取骨组织蛋白进行浓度测定。Western blot检测各组大鼠骨组织中 GRP78、PERK、IRE1α、ATF6、CHOP 及MFN2的表达水平，以GAPDH为内参，利用目的蛋白与内参的光密度比值作为相对表达量，对各组数值进行比较分析。

2.5 数据分析 数据若无说明均采用均数±标准差（mean±SD）表示。采用统计软件SPSS 20.0进行统计分析。结果中多组比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），组间两两比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 骨细胞凋亡检测 TUNEL染色结果表明，对照组有个别细胞凋亡，与对照组相比，模拟失重组大鼠骨凋亡细胞数量增多（P<0.05）；与模拟失重组相比，强骨抗萎膏组、阿仑膦酸钠组和骨疏康颗粒组凋亡细胞数量减少（P<0.05）），差异具有统计学意义，见图1。

图1 各组大鼠细胞凋亡情况

3.2 Western blot检测各组大鼠骨组织内质网应激分子GRP78蛋白的表达 Western blot的结果显示，GRP78蛋白表达量模拟失重组明显高于对照组（P<0.05），强骨抗萎膏组、阿仑膦酸钠组和骨疏康颗粒组较模拟失重组显著降低（P<0.05），见图2。

图2 各组大鼠骨组织GRP78蛋白表达

3.3 各组大鼠骨组织内质网应激相关通路分子PERK、CHOP、IRE1α 和 ATF6 mRNA的表达水平

RT-PCR检测结果显示模拟失重组PERK mRNA表达显著高于对照组（P<0.01），强骨抗萎膏组、阿仑膦酸钠组和骨疏康颗粒组较模拟失重组明显降低（P<0.01）。CHOP、IRE1α和ATF6 mRNA表达量水平在各组间无明显差异，见图3。

图3 各组大鼠骨组织PERK、CHOP、IRE1 α和ATF6 mRNA的表达

3.4 Western blot检测各组大鼠骨组织PERK及CHOP蛋白的表达 Western blot的结果显示，PERK和CHOP蛋白表达量模拟失重组明显高于对照组（P<0.05），强骨抗萎膏组、阿仑膦酸钠组和骨疏康颗粒组较模拟失重组显著降低（P<0.05），见图4。

图4 各组大鼠骨组织PERK及CHOP蛋白表达

3.5 Western blot检测各组大鼠骨组织IRE1α和ATF6蛋白的表达 Western blot的结果显示，IRE1α蛋白表达量各组间无明显差异。ATF6蛋白表达量模型组明显高于对照组（P<0.01），强骨抗萎膏组、阿仑膦酸钠组和骨疏康颗粒组较模拟失重组显著降低（P<0.01），见图5。

图5 各组大鼠骨组织IER1α和ATF6蛋白表达

3.6 Western blot检测各组大鼠骨组织MFN2蛋白的表达 Western blot结果显示，MFN2蛋白表达量模拟失重组明显低于对照组（P<0.01），强骨抗萎膏组、阿仑膦酸钠组和骨疏康颗粒组较模拟失重组显著增高（P<0.01），见图6。

图6 各组大鼠骨组织MFN2蛋白的表达

4 讨论

中医认为“肾主骨”，骨骼改变与肾密切相关[11]。故较多研究者从肾论治，开展中医药改善失重大鼠承重骨丟失的相关研究[12]。本课题组近年选用强骨抗萎膏治疗骨质疏松取得较好疗效[2-4]。强骨抗萎膏主要由熟地、骨碎补、龟板、怀牛膝等组成。骨碎补药用部分为水龙骨科附生槲蕨的干燥根茎，主要活性成分为黄酮类化合物。研究表明，骨碎补或其提取物能促进成骨细胞和破骨细胞的增殖和分化，并调节成骨细胞转录因子活性[13-14]。骨碎补总黄酮可促进IL-1β介导的软骨肉瘤细胞的增殖并抑制细胞凋亡[15]。本实验中强骨抗萎膏组较模拟失重组降低了成骨细胞凋亡，说明强骨抗萎膏在一定程度上可以缓解失重状态下骨丢失的进程。

GRP78是ERS中一个重要的分子伴侣，被认为是ERS的标志性蛋白之一。在长时间或过强的ERS反应时，UPR的所有3个分支PERK、IRE1以及ATF6与GRP78分离后，均可诱导CHOP的转录表达。CHOP是ERS介导细胞凋亡的特异转录分子[16]。本实验中，与对照组相比，模拟失重大鼠骨组织GRP78、PERK和ATF6表达量显著增高，说明失重使实验动物骨组织发生了ERS。模拟失重组与对照组相比CHOP表达水平升高，表明CHOP途径可能是失重环境引起大鼠骨组织细胞凋亡的机制之一；与模拟失重组比较，强骨抗萎膏、阿仑膦酸钠和骨疏康颗粒组，GRP78、PERK、ATF6和CHOP蛋白表达降低，说明强骨抗萎膏能减轻 ERS程度与抑制GRP78、PERK、ATF6和CHOP蛋白表达有关。本研究发现强骨抗萎膏降低了ATF6和CHOP的蛋白水平，而不影响其mRNA的表达，推测强骨抗萎膏可能通过增加ATF6和CHOP的降解而不是降低其产生来调节ATF6和CHOP。

MFN2是一种含有757个氨基酸高度保守的线粒体蛋白，具有GTPase活性。MFN2位于线粒体外膜上，在线粒体融合中起关键作用。早在2008年，研究发现，MFN2富集在内质网和线粒体之间的接触点，调节内质网和线粒体的形态[17]。在MFN2敲低的细胞中，内质网和线粒体之间的距离增加，导致线粒体Ca2+摄取受损，干扰线粒体Ca2+平衡[18-19]。也有学者发现，MFN2表达降低后增加了内质网和线粒体之间的距离，使细胞对钙离子凋亡信号更敏感[20]。另有研究表明，MFN2高表达通过促进内质网的钙离子大量涌入线粒体，造成线粒体钙超载引发凋亡[21]，具体机制有待进一步探索。本研究证实，失重状态可诱导内质网应激和细胞凋亡，MFN2表达降低，强骨抗萎膏可增加MFN2的表达，提高MFN2能保护骨组织免受内质网应激引起的细胞凋亡，在一定程度上保护失重状态下骨组织的丢失。提示强骨抗萎膏可通过上调MFN2的表达缓解失重带来的内质网应激损伤。

综上所述，强骨抗萎膏能明显降低骨组织细胞凋亡水平，减缓ERS进程，其机制可能与调控MFN2的表达、抑制ERS的激活有关，但具体的分子机制有待于进一步探讨。