穴位埋线对心肌梗死大鼠巨噬细胞MerTK胞葬作用的影响

张 薇，黄小楼，2，韦雪兰，杨 珣，2，平兰芝，吴高鑫，2*

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳 550025）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是因冠状动脉阻塞血供中断，局部心肌持续性缺血而引发的心肌坏死性疾病，其发病率逐年升高，威胁着全世界人民的健康[1]。在MI的发生发展中，炎症反应的重要性已被证实[2]。MI后局部心肌组织持续的缺血缺氧及心肌能量供应障碍，导致心肌细胞出现病理性凋亡同时出现修复性的急性炎症反应。适当炎症因子的分泌可吞噬凋亡的细胞及碎片，促进组织的修复，炎症过度表达则引发不良的心室重塑[3]。巨噬细胞表面受体MerTK的胞葬作用可通过对凋亡细胞的吞噬来避免炎症过度的发生，进而产生抗炎效应[4]。穴位埋线疗法是通过现代针具结合《灵枢·终始》“久病者……深内而久留之”的理论而衍生的一种长效针感效应的治疗方法。有研究显示[5]，穴位埋线疗法对心绞痛患者有一定的治疗作用。能明显改善其缺血发作的时间和发作的次数。课题组前期研究表明[6]，内关穴位埋线能通过抑制雷帕霉素靶蛋白质合成改善心肌梗死大鼠心肌肥大程度，对心肌产生保护效应。但炎症反应机制研究尚未开展，其机制尚未阐明。本研究通过“内关”和“心俞”穴位埋线对心梗大鼠心肌细胞大小形态改变的影响，进一步探究论证“内关”和“心俞”穴位埋线在巨噬细胞MerTK胞葬作用下对心肌梗死的保护作用机理，为穴位埋线在防治心肌梗死提供多靶点的分子实验理论依据，为该理论在临床治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取雄性SD大鼠，8～10周龄，50只，SPF级。体质量180～220 g，均由天勤（长沙）生物技术有限公司提供，合格证编号：SCXK（湘）2019-0017，室温20～25℃、湿度50%～70%，大鼠适应性喂养1周后进而造模使用。本实验过程严格遵照动物伦理学相关使用规定，伦理委员会编号：20220081。

1.2 主要试药与仪器 培哚普利叔丁胺片（上海东英药业有限公司，国药准字H20093504），戊巴比妥钠（进口分装西格玛，批号20170510），HE染色试剂盒（珠海贝索生物科技有限公司），IL-1β（ZC-36391）、IL-6（ZC-36404）、TNF-α（ZC-37624）96Test ELISA试剂盒（上海茁彩生物科技有限公司），MerTK（abs146712），P-MerTK（abs140272）兔克隆抗体（爱必信上海生物科技有限公司）。一次性辅助埋线包（扬州伊贝康医疗科技有限公司），高精度电子天平（上海力辰邦西仪器科技有限公司），小动物人工呼吸机（上海普辛仪器科技有限公司），BL-420N生物信号采集与分析系统（成都泰盟软件有限公司），酶标仪（上海卓的仪器设备有限公司），电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）等。

2 方法

2.1 造模 SD雄性大鼠采用左冠状动脉前降支结扎法（LAD）构建急性心梗大鼠模型[7]，麻醉以1%的浓度（50 mg/kg）的计量给予大鼠腹腔注入戊巴比妥钠，接着仰卧固定大鼠、备皮、气管插管、依据相关参数设定小动物人工呼吸机并将与大鼠连接，术区消毒后沿着大鼠左侧第三、四肋间钝性分离肌肉直至打开胸腔，眼科镊撕开心包膜，将心脏暴露视野，用5/0带线缝合针将位于左心耳下缘2 mm处的左冠状动脉前降支结扎。0.1 mL利多卡因注射液滴入胸腔并在缝合伤口上撒少许青霉素粉末，其作用分别是预防心律失常和伤口感染。模型构建术后，将大鼠肢体链接上Ⅱ导联，观测术后大鼠心电图，如出现ST段抬高则构建模型成功。手术全程严格无菌，伪手术组过程同模型组，但仅开胸后撕开心包膜。实验中，模型构建前心电图异常或造模不成功的予剔除。造模前后心电图见图1。

图1 大鼠模型构建前后心电图

2.2 分组与给药 将构建成功的模型大鼠以随机方式分为模型组、“内关”和“心俞”穴位埋线组、培哚普利组，同时单设伪手术组。并以术后7、28 d作为观察点，每组5只，共40只。各时间点大鼠在造模后的第2天开始干预治疗，培哚普利组药物计量按照40 mg/kg灌胃，余下3组给予相当容积蒸馏水灌胃，每天1次。“内关”和“心俞”穴位参照实验动物穴位定位标准第2版《实验针灸学》定位，将羊肠线（3-0）剪成2～5 mm长段置于75%酒精中，7号埋线针推入以上穴位。埋线出针后检查有无线头外露并用医用药棉按压针孔1 min，心俞、内关均斜刺，埋线干预7 d/次，第7、28天行相关检查。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 ELISA法检测血清中IL-6、TNF-α、IL-1β的浓度各组大鼠最后一次治疗后，禁食不禁水12 h，麻醉后的大鼠行腹主动脉取血，全血静置15 min，3 500 rpm离心10 min，移液枪将血清移入离心管，ELISA试剂盒实验操作按照说明书对各组别大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β 浓度进行检测。

2.3.2 HE染色 严格无菌操作下，取出心脏组织，沿心脏最大横径将心脏分为上下部分，4%多聚甲醛将心脏上半部分固定，石蜡包埋心脏上半部组织，切片厚度5 μm，不同浓度酒精脱水，用二甲苯进行脱蜡处理，HE染色，切片封固，高清全景扫描仪采集切片图像，应用Image-J软件对心肌细胞横切面积进行测量。

2.3.3 Western blotting检测心肌组织 MerTK、p-MerTK的蛋白表达 将梗死心肌周围组织放入研磨管中，组织研磨管中加入强RIPA裂解液，裂解后提取各时间组大鼠心肌组织中的蛋白含量，BCA法测定蛋白浓度。待100 V电压稳定15 min后开始电泳，PVDF膜放200 mA电流中转膜1～2 h，并放入孵育盒。一抗 MerTK、p-MerTK孵育，浓度 1：1 000，βactin浓度1：50 000，二抗孵育，均匀滴入发光液，曝光显影成像，Image-J软件分析处理蛋白灰度，各时间组蛋白灰度值相比β-action灰度值，得到目的蛋白灰度表达。

2.4 统计学处理 各时间点实验数据选用SPSS 26.0进行统计并分析，实验数据计量单位以（±s）表示。选用单因素方差分析，其计量资料先进行正态和方差齐性检验，方差齐性选择“LSD”。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各时间点大鼠心肌组织HE染色情况和心肌细胞横截面积比较 术后7、28 d不同时间点的伪手术组心肌细胞的大小、形态均未发生明显改变、细胞间平行排列且有序，细胞核呈现出卵圆形，位居细胞中央。模型组心肌细胞大小形态异常、呈肥大改变且错乱排列，游离细胞核增多，见明显的细胞间质，两治疗组心肌细胞形态相对规则，排列相较平行有序，心肌细胞核游离及肥大的情况不同程度改善。见图2。

图2 各时间点大鼠心肌细胞HE切片结果（×400）

术后7 d，模型组大鼠心肌细胞横截面积明显大于伪手术组（P＜0.05），两治疗组大鼠心肌细胞横截面积均小于模型组（P＜0.05）。术后28 d，模型组大鼠心肌细胞横截面积明显大于伪手术组（P＜0.05），两治疗组大鼠心肌细胞横截面积均小于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各时间点大鼠心肌细胞横截面积结果相比较（±s）

表1 各时间点大鼠心肌细胞横截面积结果相比较（±s）

注：与伪手术组大鼠相比较，＃P＜0.05；与模型组大鼠比较，*P＜0.05。

组别 n 治疗后7 d（μm2）治疗后28 d（μm2）伪手术组 5 203.78±15.31 244.4±16.01模型组 5 372.54±7.74＃ 676.8±41.45＃埋线组 5 347.98±14.48* 533.6±32.44*培哚普利组 5 280.48±9.81* 459.6±35.10*

3.2 各时间点大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平相比较 术后7、28 d，模型组大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β浓度水平明显高于伪手术组（P<0.05）。治疗后 7 d，大鼠血清 IL-6、TNF-α、IL-1β 两治疗组大鼠均低于模型组（P<0.05）。治疗后28 d，相较于模型组，两治疗组大鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β均不同程度降低（P<0.05）。见表2、表3。

表2 7 d各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β浓度的变化（±s）

表2 7 d各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β浓度的变化（±s）

注：与伪手术组大鼠相比较，＃P＜0.05；与模型组大鼠比较，*P＜0.05。

组别 n IL-1β（pg/mL）伪手术组 5 2.23±0.19模型组 5 4.88±0.48＃埋线组 5 4.15±0.25*培哚普利组 5 3.22±0.17*IL-6（pg/mL）11.98±0.42 20.84±0.82＃17.57±1.44*15.47±0.83*TNF-α（pg/mL）12.69±0.84 27.05±1.10＃24.01±1.61*19.34±1.84*

表3 28 d各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β浓度的变化（±s）

表3 28 d各组大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β浓度的变化（±s）

注：与伪手术组大鼠相比较，＃P＜0.05；与模型组大鼠比较，*P＜0.05。

组别 n IL-1β（pg/mL）伪手术组 5 1.84±0.13模型组 5 5.91±0.56＃埋线组 5 3.21±0.28*培哚普利组 5 2.64±0.23*IL-6（pg/mL）10.58±0.65 22.65±1.10＃15.40±0.63*13.36±0.58*TNF-α（pg/mL）12.42±0.71 30.75±1.16＃20.38±1.85*15.16±0.60*

3.3 各时间点大鼠蛋白MerTK、p-MerTK表达水平比较 术后7、28 d，模型组大鼠MerTK蛋白表达明显低于伪手术组（P<0.05），而p-MerTK蛋白表达高于伪手术组（P<0.05）。治疗后7、28d两治疗组MerTK蛋白水平均高于模型组（P<0.05），而p-MerTK蛋白低于模型组（P<0.05）。MerTK、p-MerTK呈反比。见表4、图3。

表4 7、28 d各组大鼠MerTK、p-MerTK蛋白表达比较（±s）

表4 7、28 d各组大鼠MerTK、p-MerTK蛋白表达比较（±s）

注：与伪手术组大鼠相比较，＃P＜0.05；与模型组大鼠比较，*P＜0.05。

7 d 28 d组别 n MerTK p-MerTK伪手术组 5 1.250±0.024 0.566±0.012 1.227±0.011 0.478±0.005 MerTK p-MerTK 1.154±0.014#埋线组 5 1.033±0.027*培哚普利组 5 0.898±0.013*模型组 5 0.894±0.016#0.926±0.018*1.111±0.009*1.247±0.004#0.664±0.007*0.687±0.274*0.736±0.013#0.826±0.010*1.049±0.198*

图3 各组大鼠MerTK和p-MerTK表达

4 讨论

在中医学中心肌梗死属“胸痹、真心痛”等范畴，本虚标实乃该病病机[8]，在治疗选穴中选用既是手厥阴心包经之络穴，又为八脉交会穴中通阴维脉的“内关”，加上即可调节脏腑气机又可扶正补虚的属足膀胱经之穴的背俞穴“心俞”[9]，两穴合用可补心养气、通脉止痛。本实验通过手术结扎大鼠LAD，术中被结扎处心肌组织变白、术后大鼠心电图ST段抬高，提示心肌缺血受损，造模构建成功，经穴位埋线干预治疗后7、28 d心肌细胞的排列、形态、大小、细胞核游离情况均有所改善，揭示穴位埋线对MI后的心肌细胞有一定的治疗和保护效果，该实验结果与课题前期研究结果大体相同[6]。

巨噬细胞是心脏中固有免疫细胞群的一种，在MI情况下被激活，巨噬细胞可分为M1型和M2型巨噬细胞，其主要作用分别是促炎和抗炎。两种分型的巨噬细胞参与了心肌梗死后的急性炎症期、纤维增殖期和稳定恢复期的全过程[10]。MI后的细胞和受损基质释放危险信号激活先天免疫补体级联，导致中性粒细胞和促炎单核/巨噬细胞快速浸润在梗死区[11]，从而M1型巨噬细胞分泌大量IL-6、TNF-α、IL-1β等促炎因子以促进梗死的细胞清除，但心梗后炎症的过度表达与不良心室重塑中的心肌肥大关系密切，心肌肥大增加了复发性心梗、心律失常、猝死等不良心肌事件的风险[12]。因此，炎症的精准调控与巨噬细胞的平衡有望成为干预梗死后不良心室重构的一种新方法和策略。MerTK是受体酪氨酸激酶Tyro-Axl-MerTK（TAM）家族成员之一，存在于巨噬细胞的表面[13]，其胞葬作用通过“识别我”“找到我”“吞噬我”发挥对凋亡细胞的吞噬和其代谢产物之间的相互作用，实现炎症的负向调控发挥抗炎效应。有研究表明[14]MerTK基因缺乏的小鼠在败血症中，小鼠的TNF-α表达异常升高，Mer受体酪氨酸激酶信号能调节TNF-α等促炎因子的分泌，减轻因内毒素引起的休克。Wan等[15]在心肌梗死小鼠模型中发现，体内MerTK基因缺乏，凋亡心肌细胞会过多积累，心脏收缩功能受损，缺血坏死组织持续扩大。本实验结果中造模后7、28 d与伪手术组相比较，模型组大鼠IL-6、TNF-α、IL-1β表达显著上升，MerTK蛋白水平著降低，p-MerTK蛋白水平明显升高，经穴位埋线和培哚普利7、28 d的治疗后大鼠血清中 IL-6、TNF-α、IL-1β表达下降，MerTK蛋白表达不同程度上升，p-MerTK蛋白水平不同程度下降。从实验结果中我们推测由于MerTK的减少，心梗后的大鼠巨噬细胞胞葬和桥接作用减弱，凋亡细胞不能迅速被识别，吞噬作用减慢，梗死心肌周围被大量炎性细胞浸润，导致炎症过度的表达。穴位埋线对心肌的保护作用可能与维持心肌组织内巨噬细胞表面受体MerTK的水平，从而降低IL-6、TNF-α、IL-1β炎性细胞因子的产生介导炎症消退相关。

综上，“内关”和“心俞”穴位埋线疗法对MI治疗效果优良，可改善大鼠MI后心肌肥大横截面积、减轻不良心室重塑，且有就诊次数少、穴位刺激长效、创伤疼痛相对较低的优势，值得推广。但目前我们只从动物实验部分分子机制出发，探讨了其中的可能性，下一步我们将多维度出发，更长期的有效性、针药结合等优效性观察以及增加明确的信号通路和增加临床试验将是我们后续重点。