缺血性骨坏死动物模型研究进展

占泽铭 黄仁泰 陈云丰

缺血性骨坏死又称无菌性骨坏死、骨梗塞，其发病与许多因素相关，包括创伤、使用糖皮质激素、酗酒、沉箱病、戈谢病、风湿性疾病等[1]。目前，各类骨坏死疾病的病理生理机制尚待研究，其诊断、治疗及预防仍是临床医生的难题。合适的动物模型可以反映病理条件下体内微环境的变化，在一定程度上反映人类疾病的进展。然而，由于研究目的和实验条件的差异，对于不同骨坏死部位仍缺乏标准的动物建模方法。本文回顾相关文献，对各类缺血性骨坏死动物模型的研究进展进行综述。

1 创伤性造模方法

1.1 手术造模

创伤性因素是引起骨坏死的最主要原因，因股骨颈骨折等创伤性因素导致骨折处周围血供破坏并引起血液循环受阻﹐则会发展为股骨头坏死[2]。有学者为研究肝细胞生长因子（HGF）基因修饰骨髓基质干细胞治疗缺血性骨坏死的效果，建立了一种兔早期骨坏死模型[3-4]。他们通过后侧切口切断股骨头圆韧带并剥离周围软组织，从根部切断股骨头后再缝合关节囊，术后行CT、磁共振成像（MRI）检查发现，3 周后造模动物明显出现符合国际骨微循环研究协会（ARCO）坏死分期的一期或二期特征。Zhang 等[5]使用类似方法进行动物造模。他们在骨槽刀造成股骨颈骨折的基础上，将骨折端分离2～3 min 后再用缝线固定，术后2周MRI 图像即可见股骨头塌陷征象。此类造模方法的优点是考虑了骨坏死的生物力学因素，能够模拟骨折导致的创伤性骨坏死发病机制；缺点是操作难度较高，动物死亡率高。

Perthes 病是仅见于儿童的特发性髋关节缺血性坏死综合征，发病率为0.4/10 万～29.0/10 万[6]。儿童因骨骼发育尚未成熟，且股骨头血供与成人不同，学者们常采用手术方式阻断骨周围血供来建立Perthes 病动物模型，其中通过股骨颈结扎法建立的仔猪Perthes 病模型最常用且最成熟。自2001 年起Kim 等[7]采用仔猪建立Perthes 病模型。他们以手术方式切断仔猪股骨头韧带，并用不可吸收缝合绷带结扎同侧股骨颈以阻断血供，术后行影像学、组织学和大体标本检查，证实成功诱导仔猪股骨干骺端缺血性坏死，并与Perthes 病的病理生理表现相似。之后此方法成为经典的Perthes病动物造模方法，至今学者们仍主要采用此方法进行Perthes 病诊断和防治的研究[8-9]。不过该方法存在不足之处，如动物体积较大、不适合集中饲养、价格较贵等，其适合经费充足的研究。

2015 年，Kamiya 等[10]选用5 周龄雄性C57 小鼠，通过微血管造影技术确定了供应小鼠股骨远端骨骺的4 组血管，经显微镜辅助，通过后内侧入路灼烧腘动脉骨骺分支，通过内侧髌骨旁入路切开膝关节以灼烧供应右股骨远端骨骺的膝外侧上动脉、膝内侧上动脉和膝下动脉。同时，他们将左股骨远端骨骺作为对照组进行研究。术后组织学检查证实，实验组骨骺出现骨坏死后吸收及新骨形成过程，术后4 周HE 染色显示，空骨陷窝和核固缩骨细胞数占骨陷窝总数的78%±15%，术后1周原位末端标记法（TUNEL）染色见死亡骨细胞数占骨细胞总数的98%±3%，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色见破骨细胞数显著下降，随后逐渐上升，至术后6 周达到与对照组水平相近。经微CT 图像评估骨体积百分比、骨小梁厚度发现，实验组均较对照组降低，术后6 周小鼠骨骺可见塌陷畸形，仅1 只小鼠死亡。该方法造模效果明确，骨坏死发生率为100%，许多学者均采用此造模方法进行Perthes 病后续研究。Yamaguchi 等[11]采用上述方法造模，研究年龄对缺血性骨坏死修复过程的影响，他们分别选取5 周、12 周、22 周和52 周龄的雄性C57 小鼠，于造模术后2 d 或4 周处死小鼠。TUNEL 染色显示，各年龄组均可见广泛的骨细胞死亡，证实该造模方法适用于不同年龄段小鼠。此方法可模拟临床上因创伤后骨骺周围血供破坏导致的缺血性骨坏死，其成模效果可靠，已逐渐成为常用的造模方式。该方法的缺点是显微操作较复杂，手术切口多，对动物造成损伤较大，且远端骨骺不能完全模拟其他部位（如股骨头等）的骨坏死病理生理过程。

1.2 液氮造模

液氮造模的原理是通过液氮低温造成骨细胞及骨间充质细胞的损伤以及骨周围血管痉挛，损伤血管内皮细胞，导致血管内凝血，血管通透性增加，继而发生出血和复温后缺血再灌注损伤，进一步诱发血栓形成，冷冻区域血供减少，加重骨细胞损伤、骨质坏死，导致缺血性骨坏死[12-13]。

Wang 等[14]采用新西兰大白兔进行造模。他们横切兔股骨头圆韧带，然后立即用浸泡液氮的克氏针接触股骨头表面，造成血管内皮细胞损伤，进而影响血管的正常功能。术后1 个月大体观察、微CT 及MRI 检查均证实发生股骨头坏死。Li 等[15]使用成年雌性小尾寒羊进行造模。他们在股骨头-颈交界处的股骨头负重区域钻孔，将冷冻探针插入隧道，诱导股骨头血管发生低温损伤，1 个月后行组织学检查见大量空骨陷窝出现，成功建立了股骨头坏死的羊模型。

液氮造模的主要优点是造模周期短、动物死亡率低，具有良好的可重复性，能够快速稳定地制备大量动物模型。缺点在于，该方法不是导致骨坏死的正常病因，不能用于骨坏死发病机制的研究，只能用于治疗和预后的研究。

1.3 化学方法造模

化学方法造模是通过化学物质（通常为乙醇）直接作用于骨骼局部，对骨内部结构进行化学灭活而形成病变，国内外学者大多将该方法应用于股骨头坏死的造模研究。

顾江江等[16]采用青脚麻鸡为模型动物﹐对其股骨头中心钻孔﹐并在孔内注射乙醇灼烧骨质，破坏骨内血供后再植入原骨，1 个月后通过微CT图像观察﹐发现骨体积分数、平均小梁间距、平均骨小梁数量与对照组及未处理组相比均有显著性不同﹐表明成功建立了股骨头坏死模型。Yuan等[17]采用羊为模型动物﹐将无水乙醇注入羊距骨中，分别于术后2 周、4 周、12 周、24 周取材观察股骨头缺血性坏死情况，通过X 线、CT 检查及组织学观察确定距骨骨坏死模型成功建立﹐证实该方法可应用于股骨头以外部位的骨坏死造模，为距骨坏死干预研究创造了模型基础。

化学方法造模的优点是可重复性高，操作简易。它的缺点是缺乏统一的化学物质用量标准，骨内可能残留化学物质，从而破坏骨组织结构。此外，该方法也不是导致骨坏死的正常病因，不适用于骨坏死发病机制的研究。

1.4 介入栓塞造模

近年来，血管介入栓塞造模方法逐渐兴起﹐该方法可以减少手术创伤法导致实验动物损伤过大、死亡率高的问题。其方法主要分为两类：①骨内注射栓塞材料导致骨内压升高，静脉回流障碍，引起局部骨组织缺血坏死；②将栓塞材料直接注入动脉，使动脉栓塞导致相应的骨组织坏死。

张开放等[18]以介入栓塞法制作兔动物模型。他们以骨穿刺针穿入股骨颈中央，注射医用-氰基烯酸酯类胶导致骺板缺血，然后将动物置于定制的高笼中饲养，迫使动物饮食时以后肢负重。术后造模动物出现跛行，关节周围肿胀，关节间隙增宽，骨密度下降，骨小梁内坏死细胞增多。廖勇[19]使用聚乙烯醇(PVA)、明胶海绵颗粒、栓塞弹簧圈等不同栓塞材料，采用山羊为造模动物﹐对比不同栓塞材料对造模的影响，术后6 周行病理学检查发现，实验组空骨陷窝百分比、骨小梁面积百分比均明显低于对照组﹐并发现单独应用栓塞材料时，PVA 的造模效果最佳，而联合应用3 种栓塞材料较单独应用1 种材料的造模效果更好。

血管栓塞造模法效果明确，对实验动物损伤小，但手术精细，操作难度较大，通常需选用大型动物建模，且目前对栓塞剂的选择并未取得共识。

1.5 物理加热造模

物理加热法也是新的造模方法。该方法通过物理方法（如微波、高强度聚焦超声）对股骨头加热造成骨坏死，可形成与人类股骨头坏死相似的病理表现，具有造模方法简单、周期较短、造模稳定的优点，但需要特定设备，有一定局限性。

彭吾训等[20]对微波加热制作兔股骨头坏死模型的设定温度及时间开展研究。他们分别以50℃10 min、50℃20 min、55℃10 min、60℃10 min的条件造模，然后行组织学检查及MRI 检查。研究结果显示，以55℃10 min 进行造模，4 周后即出现骨坏死及修复现象，12 周时可出现股骨头坏死塌陷表现，塌陷率为75%。他们认为，55℃10 min为最适宜造模的微波温度和时长。徐燕等[21]对高强度聚焦超声建立骨坏死模型的可行性进行探索，他们以80 W/cm2强度超声照射兔股骨头，并于照射后1 d、7 d、14 d、21 d 分别行大体形态观察及组织学检查。研究结果显示，此方法形成的骨坏死具有清晰的病理演变特征，显示出高强度聚焦超声应用于骨坏死造模的可行性。

2 非创伤性造模方法

2.1 激素诱导

激素是导致股骨头坏死的第二大病因[22]，许多学者通过激素诱导的方法来建立动物模型，以模拟人激素性股骨头坏死[23]。该造模方法操作方便，对动物创伤小，但不同学者采用的激素种类不同，剂量和给药途径也存在差异，方法较难标准化。此外，单独应用激素还存在坏死部位不集中、动物死亡率高、造模成功率低等缺点[24]。为避免其不足，一些学者采用间断性给药，以降低动物死亡率，达到稳定建模的效果。Liu 等[25]采用健康雌性小鼠造模。他们给予小鼠肌内注射甲基强的松龙20 mg/kg，每周前3 d 注射3 次后停4 d，连续使用3 周后停3 周，用时共6 周。他们发现，造模小鼠全数存活，微CT 检查显示其股骨头软骨面变薄，骨小梁稀疏，HE 染色见骨陷窝内骨细胞减少。

2.2 激素联合脂多糖诱导

脂多糖（LPS）为外源性致热源，其可通过介导一系列炎症因子表达诱导血管中的内皮细胞凋亡，并可通过内源性凝血途径引起机体的高凝状态。LPS 与激素合用可造成血管内凝血﹐影响血液循环。临床中多数骨坏死患者系患有免疫系统疾病（如哮喘、系统性红斑狼疮），这些免疫系统疾病导致机体产生微循环障碍，在大量、长期的激素治疗后发展为激素性骨坏死[26]。因此，激素联合LPS的造模方法逐渐为广大学者所用。

Lv 等[27]采用SD 大鼠造模，于第1 天、第2天肌内注射LPS 1.0 mg/kg，然后连续3 d 注射甲基强的松龙40 mg/kg，4 周后通过组织病理学检查发现，造模大鼠出现股骨头的骨小梁断裂、骨陷窝内骨细胞减少，TUNEL 法检测显示实验组股骨头骨细胞凋亡率高于对照组。Jin 等[28]则选用雌性C57小鼠进行造模研究，他们于第1 天、第2 天给予小鼠腹腔注射LPS 20 μg/kg，2 d 后每天肌内注射甲基强的松龙 40 mg/kg，并提高喂养槽高度以强迫小鼠站立进食，同时每天将小鼠置于旋转笼中，鼓励活动2 h，4 周后通过组织病理学检查发现，成模率为80%，小鼠死亡率为16.7%。

2.3 激素联合异种动物血清诱导

类似于LPS，异种动物血清（如马血清）能诱发机体出现超敏免疫反应，使血管内皮受损，形成血管炎症。使用激素联合马血清则可导致微血管栓塞，从而提高建模成功率。王小龙等[29]使用静脉注射马血清加腹腔注射甲基强的松龙的方法对新西兰大白兔进行造模，4 周后模型大体标本及MRI 图像均可见骨坏死表现，造模成功率为84.62%，动物死亡率为13.33%。

2.4 酒精诱导

酒精性骨坏死常发生于中青年过量饮酒者，在男性股骨头坏死病因中占30.68%[26]。近年来，酒精性骨坏死的发病率不断升高。因此，学者们采用酒精灌胃、含酒精饮食等方法进行骨坏死动物造模，以模仿过量摄取酒精导致的骨坏死。

杨云等[30]使用酒精灌胃法给予Wistar 大鼠46°白酒，并采用抬高喂养槽的方法使其进食时下肢承重，以更接近人类的生物力学作用，6 个月后造模成功率达89.48%，但未出现股骨头变形塌陷及髋臼磨损改变，大鼠死亡率为10%。Yang 等[31]使用酒精对大鼠进行6 周喂养，初始酒精浓度为5%，以后每周增加5%，最后酒精浓度稳定于30%。该方法比灌胃法更人道，操作更简单。6 周后经微CT 和组织病理学检查证实，大鼠股骨头软骨下区出现多发弥漫性空腔隙及骨髓坏死，10 只大鼠中8 只出现严重股骨头坏死。

高浓度酒精灌胃法的成模率高，但动物死亡风险也随之增高，且存在乙醇浓度无统一标准，坏死部位不集中等缺点。目前大部分有关酒精建模的研究都无法进展至股骨头塌陷阶段[32]，造模方案还需进一步改良。

2.5 减压诱导

减压性骨坏死属于比较罕见的骨坏死类型，主要发生于一些特殊工作人员（如潜水作业员、沉箱作业员等），他们在高气压环境下突然下降至正常气压后，原溶解于血液中的氮气释出，并在骨髓中大量堆积，最终导致骨坏死。建立减压性骨坏死动物模型可用于研究其病理机制、诊治及预防等[33]。

目前用于减压性骨坏死的造模动物主要有羊和猪，而豚鼠、狗等不适用。李慈等[34]进行了动物实验研究，他们用加压舱将小型猪置于0.45 MPa压力环境下6 h，然后于1 min 内将压力减至正常大气压水平，如此处理每周重复2～3 次，共持续6 个月。随后通过骨扫描及骨病理学检查发现，实验动物的肱骨头、股骨头血流淤滞，股骨头坏死变形。Sobakin 等[35]则使用绵羊进行研究，他们将绵羊置于0.28 MPa 压力环境下24 h，随后以每分钟下降0.09 MPa 的速率减压，通过骨扫描检查可见近端或远端长骨均出现骨修复现象﹐提示发生了骨坏死。

减压诱导造模的优点是骨坏死部位不局限于股骨头，还可出现其他部位如肱骨、桡骨等坏死，这对于其他部位骨坏死模型的研发和应用有启发作用。而其缺点也十分明显，此类动物模型仅能用于减压性骨坏死的相关研究，且造模周期长，对实验设备要求高。

3 结语

不同的骨坏死动物造模方法各有优劣，适合于对骨坏死不同方向的研究，目前尚无与人类骨坏死发病机制完全一致的动物模型。激素造模法符合临床股骨头坏死的发病过程，研究意义大，但对于采用激素的种类、剂量、给药方式等尚未有统一结论。对于创伤及手术后恢复不良导致的骨坏死研究，手术造模为最佳选择。对于酒精导致骨坏死的研究，可选用局部注射无水乙醇、含酒精饮食喂养等方式诱导造模。液氮造模对实验动物的损伤小，造模方法简便，建模效果稳定，是目前使用较多的方法，适用于对骨坏死治疗的研究。

在骨坏死造模领域，大部分研究集中于股骨头坏死、Perthes 病，尚缺乏对其他部位骨坏死如肱骨头坏死、距骨坏死、舟骨缺血性坏死等造模的研究。动物模型的研究能为相关疾病的发病机制、防治方案等后续研究提供基础，因此不同部位骨坏死模型的研究还需进一步探索。