基于转录组测序技术探讨电针对应激性胃溃疡模型大鼠的分子机制*

潘 婷 王海丽 李雪峰 陈春海 陈新华△

（1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021）

应激性胃溃疡（SGU）指机体在应激状态下，胃和十二指肠黏膜出现的糜烂、溃疡、出血等表现的一种急性胃黏膜病变，某些溃疡向深部发展可造成穿孔，其发生和发展的机制尚未完全明确［1］。此病的发生会严重影响人们的生活质量，但目前国内外尚无有效的防治方法，许多化学合成药物虽可治疗和控制胃溃疡及相关问题，但具有毒副作用，可能引起更多并发症［2］。胃溃疡属中医学“胃脘痛”“嘈杂”“胃疡”等范畴，针灸治疗SGU 在临床上已获得良好的效果。针灸具有良性的双向调节作用，针灸治疗胃溃疡是从多方面、多层次的综合调理，起到保护胃黏膜的作用［3-4］。本研究通过对大鼠进行电针针刺治疗后建应激性胃溃疡模型大鼠，观察各组大鼠胃黏膜损伤和胃组织基因表达谱的情况，以期为电针治疗应激性胃溃疡的应用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠24 只，体质量180～220 g，生产许可证号：SCXK（吉）2020-0002。大鼠在长春中医药大学动物中心喂养，自然照明，室温为（25±3）℃，相对湿度为（55±5）%，普通饲料喂养，自由饮水，保持自然生物节律。实验过程按长春中医药大学动物伦理委员会的要求进行，伦理审查批准编号：2021222。

1.2 试剂及仪器

鼠维持用颗粒饲料（长春市亿斯实验动物技术有限责任公司）；不锈钢无菌针灸针（贵州安迪药械有限公司生产，0.18×10 mm，产品批号：20182270011）；SDZ-V 型电子针疗仪（产品批号：YZB/苏0691-2013）；小动物专用吸入麻醉机（美国MATRX VMR）；多聚甲醛固定液（产品编号：BL539A，Biosharp）；RNAlater 固定液（产品编号：R0118，Beyotime）；TRIzol（Invitrogen公司，美国）；NEBNext® Magnesium RNA Fragmentation Module（货号E6150S，美国）；Bioanalyzer 2100（Agilent公司，USA）；Invitrogen SuperScript ⅡReverse Transcriptase（货号1896649，美国）；E.coli DNA polymerase I（NEB，货号m0209，美国）；RNase H（货号m0297，美国）；dUTP Solution（货号R0133，美国）；illumina NovaseqTM6000（LC Bio Technology CO.杭州，中国）等。

1.3 分组与干预

将大鼠适应性饲养7 d 后分随机分为空白组（8只）、模型组（8 只）、电针组（8 只）。1）空白组：常规喂养，无任何处置。2）模型组：适应性喂养7 d，与电针组同期使用异氟烷于麻醉机中进行麻醉，每日1 次，每次20 min，共7 次。第8 天采用水浸束缚法（WIRS）进行造模。3）电针组：适应性喂养7 d，将大鼠使用异氟烷于麻醉机中进行麻醉后，取穴参照《实验针灸学》《大鼠穴位图谱的研制》记载的腧穴位置，选择足三里、内关进行电针针刺治疗。每日1次，每次20 min，共7次，第8 天采用束缚-水浸应激法进行造模。针刺后分别以单侧内关、足三里为电针连接对穴，连接华佗牌SDZV型电子针疗仪，调至连续波，频率20 Hz，强度为1。

1.4 模型制备

针刺干预结束后，将电针组与模型组进行WIRS造模［5］。大鼠禁食、不禁水24 h，造模时用绳子将其四肢缚住，背部固定于在自制金属网上，使其头部在上、尾部在下，垂直放入（22±2）℃的恒温水箱中，保持水的液面始终在大鼠胸骨剑突，水浸时间为12 h。

1.5 标本采集与检测

1）胃黏膜损伤评估：各组大鼠在呼吸麻醉状态下开腹，抽取大鼠腹主动脉血，取胃组织，用提前放置在4 度冰箱中的生理盐水冲净胃组织表面血迹后，将胃展开，用游标卡尺将展开的胃组织进行测量，测量溃疡面最大长径和最大横径并计算出胃黏膜损伤指数（UI）。评分标准如下：斑点糜烂1 分；糜烂直径＜1 mm 2 分；1 mm＜糜烂直径＜2 mm 3 分；2 mm＜糜烂直径≤4 mm 4分；糜烂直径＞4 mm 5分；宽度＞2 mm时分值×2；最后将分数相加即为溃疡指数（UI）。2）HE染色病理分析：完成大鼠胃黏膜损伤评估后，将1/4胃组织分组放入10 mL试管中，4%多聚甲醛溶液浸泡24 h，脱水，包埋，切片，显微镜下观察大鼠胃黏膜病理变化，将1/4剩余胃组织于-80 ℃下保存，以便在后续实验中使用。3）将1/2胃组织放入RNAlater 固定液中，常温放置24 h 后，放入-80 ℃冰箱中保存备测。对总样品的RNA 进行分离和纯化，对总RNA 的量与纯度进行质控，然后对RNA的完整性进行检测，同时通过琼脂糖电泳的方案进行验证。通过两轮的纯化对其中的带有多聚腺苷酸的mRNA进行特异性捕获。在高温条件下将mRNA进行片段化，并通过逆转录酶的作用合成cDNA。将处理后的DNA 与RNA 的复合双链转化成DNA 双链，对其片段大小进行筛选和纯化，最终形成片段大小为（300±50）bp 的文库。最后，使用illumina NovaseqTM6000 按标准操作对其进行双端测序，测序模式为PE150。使用R 包对样本之间进行显著差异分析，将差异倍数FC＞2倍或FC ＜0.5倍且P＜0.05的基因定义为差异基因，并对其进行GO和KEGG富集分析。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠UI比较

见表1。造模过程中模型组和针刺组各有2 只大鼠挣脱束缚，故排除，最后纳入6 只进行比较。与空白组相比，模型组大鼠胃黏膜损伤指数较空白组高（P＜0.01），说明本实验建立的胃溃疡大鼠模型较理想。与模型组大鼠相比，电针组胃黏膜损伤指数有明显降低（P＜0.01），说明预电针干预可使SGU 大鼠胃黏膜损伤指数降低。

表1 各组大鼠UI比较（mm，±s）

表1 各组大鼠UI比较（mm，±s）

注：与空白组比较，**P ＜0.01；与模型组比较，△△P ＜0.01。

UI 0.00±0.00 17.52±2.05**9.46±1.52△△组 别空白组模型组电针组n8 6 6

2.2 各组大鼠胃组织大体形态比较

见图1。空白组胃黏膜肉眼可见光滑完整，颜色呈淡粉色；模型组可见多处出血点（如图2 模型组黑色箭头所示），且出血点大小形态不一。电针组与模型组相比其出血点面积较小，且分布较散（如图1 电针组黑色箭头所示）。

图1 各组大鼠胃组织肉眼大体形态比较

图2 各组大鼠胃组织病理结果比较（HE染色，200倍）

图3 各组小鼠差异基因表达的影响比较

2.3 各组大鼠胃组织病理观察结果比较

见图2。空白组大鼠胃组织细胞结构光滑完整、排列整齐有序。模型组大鼠胃组织结构破损，细胞排列杂乱无序，细胞内多处可见充血、毛细血管出血，在扩张的血管内可见大量胞浆红染。电针组胃组织表面有部分脱落，上皮细胞受损部位表浅且范围较小，细胞内充血情况较模型组明显减少，炎症细胞浸润较少（如图2黑色箭头所示）。

2.4 各组大鼠胃组织转录组学分析

2.4.1 差异基因表达筛选 对差异表达基因进行筛选，我们以差异倍数FC≥2 或FC≤0.5（即log2FC 的绝对值≥1）且P＜0.05 作为标准，认为由此筛选出的基因为差异表达基因。测序结果显示，模型组与空白组比较，筛选出的显著差异基因共1 161 个，其中上调基因555个，下调基因606 个，排名前10 的基因见表2。电针组与模型组比较，筛选出的显著性差异基因共51 个，其中上调基因23个，下调基因28个，排名前10的基因见表3。电针组与空白组比较，筛选出的显著性差异基因共有1 595 个，其中上调基因853 个，下调基因742 个，排名前10 的基因见表4。同时统计了3 组比较的差异基因，共有7个，基因名分别为LOC108348108、LOC299282、Crabp2、Elovl6、RT1-CE10、Steap4、Pfkfb3。

表2 模型组与空白组显著性差异基因（top10）

表3 电针组与模型组显著性差异基因（top10）

表4 电针组与空白组显著性差异基因（top10）

2.4.2 差异基因的GO 富集分类分析 对各组的差异基因进行GO富集分析，以P＜0.05为筛选标准。GO富集分析主要包括生物过程（Biological Process）、细胞组成（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）。由于在生物过程、细胞组分、分子功能这3 种GO function 上富集的GO Term 数目比较多，无法把所有的注释结果都展示在一张图中，因此3 种GO function 我们根据注释到GO Term 的差异基因数目由大到小降序排列，分别挑选Top25、Top15、Top10的GO Term进行绘图展示。通过GO 富集分析可以看出，电针组和空白组相比，差异基因在细胞组成中有487 条差异基因富集于细胞膜（membrane），在分子功能有306 条差异基因富集于蛋白结合（protein binding），在生物过程中有112 条差异基因富集于生化过程（biological_process）图4b 得到的共表达差异基因在细胞组成中富集最多的是细胞质（cytoplasm），为12 条，而在分子功能中8 条差异基因具有蛋白结合（protein binding）功能，在生物过程中差异基因聚集最多的两个类群是翻译（translation）和氧化还原（oxidation-reduction process），均为4 条。图4c 得到的共表达差异基因在细胞组成中富集最多的是细胞膜，有373 条，在分子功能中差异基因聚集最多的两个类群是蛋白结合（protein binding）和金属离子结合（metal ion binding），分别为221和134条，在生物过程中富集最多的是生化过程和氧化还原2个类群，分别为79、72条。

图4 差异基因GO富集分析

2.4.3 差异基因的KEGG 代谢通路富集分析 对差异转录本KEGG 通路进行分析，根据KEGG 富集的显著性（pvalue）取Top20 的pathway 进行气泡图绘图展示（如图5 所示）。其中电针组与空白组相比差异转录本共富集到301条通路，其中排名前5的分别为癌症通路（Pathways in cancer）、单纯疱疹病毒1 型感染（Herpes simplex virus 1 infection）、PI3K-Akt 信号通路（PI3KAkt signaling pathway）、人乳头瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）和MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）。空白组与模型组相比差异转录本共富集到290 条通路，其中排名前5 的分别是癌症通路（Pathways in cancer）、单纯疱疹病毒1 型感染（Herpes simplex virus 1 infection）、PI3K-Akt 信号通路（PI3KAkt signaling pathway）、人类乳头瘤病毒感染（Human papillomavirus infection）和受体相互作用（Cytokinecytokine）。电针组与模型组相比差异转录本共富集到66 条通路，其中排名前5 的分别为雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、抗原处理及呈递（Antigen processing and presentation）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease）、细胞黏附分子（Cell adhesion molecules）和内吞作用（Endocytosis）。

图5 各组差异基因KEGG富集分析

3 讨 论

SGU 发病机制尚不明确，且因其病程较长没有特效药，所以临床上有效的治疗手段较少。中医药治疗SGU多以辨证施治，调和脏腑机能，以达到标本兼治的目的。该病病位在胃，与肝脾相关，病性多为本虚标实，治疗以条畅气机、补益气血为主。针灸以其简便易行、安全性高、价廉效优的独特优势在治疗此类疾病上具有明显优势，其治疗原则为调和气血、缓急止痛、疏通经脉，治疗机理与发病机制密切相关，主要通过调节神经内分泌系统功能、平衡胃黏膜损伤因子和防御因子的相互关系从而影响SGU，缓解其症状。在本实验中选取足三里和内关穴，进行按部位上下取穴法。足三里为胃经下合穴，具有通降腑气、扶正祛邪、培补中焦、运脾和胃、行气活血的作用。下合穴是六腑之气输注出入的部位，依据“合治内腑”“合主逆气而泄”“肚腹三里留”的理论可知下合穴用于治疗腑病，其中足三里是治疗胃腑病的主穴。内关穴为心包经络穴，又是八脉交会穴，联络三焦，通于阴维脉。内关穴可调畅三焦气机，和胃止痛，尤对气滞血瘀证之胃脘痛效果更佳［6］。另外，内关穴常可与足三里穴合用，调理脾胃。

本研究通过构建空白组、模型组、电针组胃组织的转录组文库，获得全部基因表达谱，并对差异基因进行分析，针对这些差异基因进行了GO 功能分类，KEGG代谢通路分析，通过其分析结果并查阅相关文献，在富集通路中与应激性胃溃疡发生发展密切关联的通路有PI3K/Akt 信号通路和MAPK 信号通路［7-11］。PI3K 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶［12］，Akt 是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，参与细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡等过程［13］，PI3K 由催化亚基p110 与调节亚基p85 构成，其被激活时，p110 可诱导PIP2 转变为PIP3 与Ak 结合促使其活化［14-15］，PI3K、Akt 基因及蛋白异常表达会促进细胞发生凋亡并推动胃溃疡疾病进展。MAPK 通路主要参与细胞应激反应和损伤反应，通过干扰基因的转录和调控，来调节细胞増殖、分化和凋亡等，可在伤害性刺激、生长因子及炎症介质等因素影响下被激活，参与多种神经病理痛的形成［16］。

有研究表明理中汤可明显降低胃溃疡大鼠血清炎症水平，下调大鼠胃组织PI3K、Akt 蛋白表达，可能与调控PI3k/Akt 通路有关［17］；也有研究认为，PI3K、Akt基因及蛋白表达水平异常会促进炎性细胞因子释放并诱导胃黏膜细胞发生凋亡，从而加重胃溃疡病情。PI3K/Akt信号通路及其上下游分子可能是治疗各种炎症性疾病的靶点［18］。研究表明［19］，p38 MAPK 在被急、慢性炎症激活以后，可以改变多种细胞因子的表达，进而影响炎症病变的预后；也有研究［20-21］显示白及多糖可通过下调P38 MAPK 基因和蛋白表达水平，抑制炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）及白细胞介素-6（IL-6）异常分泌而发挥保护胃黏膜的作用。一项动物实验证实铁皮石斛多糖可通过调节MAPK 信号通路中相关基因和蛋白的表达，降低炎性因子，从而减轻无水乙醇引起的胃溃疡损伤［22］。因此，根据本次研究的结果，推断电针对胃溃疡的治疗可能通过PI3K-/AKT、MAPK 等信号通路的介导，从而对SGU起治疗作用。

综上，本研究观察电针干预后对SGU 模型大鼠的转录组学分析其相应基因的表达情况，从基因水平上预测了SGU 的形成以及针刺对胃溃疡治疗的可能作用途径，为进一步解析电针防治SGU 的分子机制研究奠定了良好的基础。本研究仍存在不足之处，由于此次研究主要是采用生物信息学的方法进行分析，大量的数据结果是基于计算机与数学的统计功能进行的预测分析，未通过RT-PCR 等技术验证转录组学数据的可靠性，这也是本课题组接下来需要完成的工作内容，同时还需要对发现的关键信号通路及其靶点进行更全面、更深层次的探究。